高智席，江忠遠，李新發(fā)，吳艷紅，牟青松，敖克厚，鄧傳躍

(1.遵義師范學(xué)院化學(xué)系，貴州 遵義 563002；2.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

固相萃取-反相高效液相色譜法測定紅毛丹中抑霉唑的殘留動態(tài)

高智席1，江忠遠1，李新發(fā)1，吳艷紅1，牟青松1，敖克厚1，鄧傳躍2

(1.遵義師范學(xué)院化學(xué)系，貴州 遵義 563002；2.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

建立固相萃取-反相高效液相色譜法測定紅毛丹中抑霉唑的殘留動態(tài)分析的方法。色譜柱為Shim-pack VPODS(150mm×4.6mm，5μm)，檢測波長229nm，流動相為甲醇-離子對溶液(75:25，V/V)，流速0.85mL/min，進樣量20μL。抑霉唑在15.0～960.0μg/L(r＝0.9994)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，檢出限為5μg/L，抑霉唑回收率為86.4%～104.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.84%～2.87%。同時，還對抑霉唑由紅毛丹皮向肉的遷移，在紅毛丹體上的降解動態(tài)進行分析。該方法操作簡便快速，可作為紅毛丹中抑霉唑含量監(jiān)測的方法。

抑霉唑；固相萃??；反相高效液相色譜；紅毛丹

抑霉唑[烯丙基1-(2,4-二氯苯基)-2-咪唑-1-基乙基醚]是近年來開發(fā)的一種結(jié)構(gòu)新穎、作用機制獨特、高效、低毒和廣譜的嘧啶胺類內(nèi)吸性殺菌劑，并具有預(yù)防和治療作用。對侵襲谷物、水果和蔬菜的病原體——交鏈孢菌、寄生霜霉、灰霉枝孢和霉根霉等具有良好的抑殺作用[1]。

紅毛丹是一種極具經(jīng)濟價值的熱帶水果，外觀美、營養(yǎng)豐富、富含碳水化合物、各種維生素和礦物質(zhì)。長期食用可潤膚養(yǎng)顏、清熱解毒、增強人體免疫力。但紅毛丹在我國只有海南等少數(shù)地區(qū)分布，主要依賴東南亞進口，儲存運輸?shù)闹芷诒容^長，保鮮能力又比較差。因此，抑霉唑常被應(yīng)用于紅毛丹收獲前和收獲后的生產(chǎn)、儲存及保鮮過程中。

通常測定抑霉唑的方法有高效液相色譜法[2-5]、氣相色譜法[6-12]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]等。但關(guān)于紅毛丹中抑霉唑殘留動態(tài)分析的高效液相色譜測定方法未見報道。本實驗擬建立固相萃取反相高效液相色譜分離，二極管陣列檢測器測定紅毛丹中抑霉唑殘留動態(tài)分析的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅毛丹(市售)，0～5℃冷藏。

抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99%) 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品信息中心；無水硫酸鈉(AR，130℃烘2h，貯于干燥器中備用)、甲醇(分析純)、磷酸(95%，分析純)、正己烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、磷酸二氫鈉(99%，分析純)；二次蒸餾水。

所有溶液使用前均由0.45μm孔徑的濾膜過濾。離子對溶液：稱4.45g Na2H2PO4·2H2O溶于1000mL二次蒸餾水中，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%磷酸調(diào)至pH≈2.5，搖勻，超聲振蕩15min，用0.45μm的孔徑濾膜過濾，備用。

LC-2010AT型高效液相色譜儀(LCsolution色譜工作站，CBM-20A系統(tǒng)控制器，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器) 日本Shimadzu公司；SY3200超聲波清洗器 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；EYELAN-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidoph公司；電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠；THZ-82A型振蕩機 江蘇富華儀器有限公司；DHG-9070A型新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱寧波江南儀器廠；混合陽離子固相萃取柱(PCX，HRXC，60mg，3mL)、24DL固相萃取裝置 Visiprep公司；微孔過濾裝置。

1.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150mm× 4.6mm，5μm)；流動相：甲醇:離子對溶液=75:25(V:V)(pH≈2.5)；紫外檢測波長：229nm；流速：0.85mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20μL。

1.3 樣品前處理及測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品0.0401g(精確至0.0001g)，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后即為質(zhì)量濃度802μg/mL抑霉唑的儲備液。用移液管準(zhǔn)確移取不同體積的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于25mL容量瓶中，再用甲醇定容得一系列不同濃度的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻并貼上標(biāo)簽，保存(0～10℃)，備用。

1.3.2 樣品前處理

樣品紅毛丹在802μg/mL抑霉唑溶液中蘸浸后取出，然后在間隔不同的時間將紅毛丹皮削下，將紅毛丹皮和紅毛丹肉分別編號并保存，樣品保存在冷藏柜里(0～5℃)。不同編號的樣品依次進行殘留量測定。

將未經(jīng)清洗的紅毛丹肉與紅毛丹皮經(jīng)組織搗碎機搗碎，各稱取其5.00g(精確到0.01g)置于帶蓋塑料離心管中，準(zhǔn)確加入30mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)和2g氯化鈉，在渦旋混合器上渦旋1min，超聲振蕩20min，在10000r/min離心機上離心10min，取上清液凈化。

分別用3mL甲醇，3mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱，準(zhǔn)確移取3mL(具體由樣品含量高低來確定)離心上清液分別上PCX固相萃取柱，過柱速度1mL/min以內(nèi)。再用3mL水和3mL甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱[16]，抽近干后用氨水甲醇溶液5mL洗脫。在40℃條件下用氮氣吹干，準(zhǔn)確加入1.00mL甲醇溶液，渦旋振蕩1min，過0.45μm濾膜，待測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器在線掃描配制好的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，可得到抑霉唑的吸收波長響應(yīng)值的紫外吸收圖譜，最大吸光度出現(xiàn)在229nm處，產(chǎn)品中各雜質(zhì)在該波長時對產(chǎn)品的測定無影響，且色譜峰形較好。因此，選擇229nm作為本方法的最適檢測波長。

2.2 流動相的選擇

分別以乙腈:離子對溶液和甲醇:離子對水溶液體系作流動相進行比較，發(fā)現(xiàn)甲醇:離子對溶液作流動相時，抑霉唑與其雜質(zhì)分離完全且峰形對稱；再經(jīng)過比較不同配比的甲醇:離子對水溶液體系[4]，發(fā)現(xiàn)甲醇-離子對溶液(75:25，V:V)，柱效最高，保留時間適宜。

2.3 流速選擇

在優(yōu)化流動相和檢測波長條件下，以0.30～1.30mL/min的不同流速進行測定，分析比較發(fā)現(xiàn)在0.85mL/min流速下的抑霉唑液相色譜峰形較好、出峰時間較早，故選擇0.85mL/min為檢測流速。

2.4 線性范圍及檢出限

按照上述色譜條件，以質(zhì)量濃度為橫標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)過回歸，得到其線性方程為Y＝15.502X－290.38，r＝0.9994。線性范圍為15～960.0μg/L。抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)出峰在2.1765min。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的最低濃度點，按上述色譜條件測定6次，得一組低濃度標(biāo)準(zhǔn)峰面積，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以方法的靈敏度，即得方法的檢出限為5μg/L。抑霉唑標(biāo)樣色譜圖和樣品色譜圖見圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)和紅毛丹肉(B)中抑霉唑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of imazalil standard and imazalil in rambutan flesh

2.5 方法的精密度和回收率

在選定的色譜條件下進行添加回收實驗，紅毛丹肉分別以0.01、0.05、0.1mg/kg 3個添加水平，紅毛丹皮分別以0.05、0.1、0.2mg/kg 3個添加水平，按照樣品處理方法進行提取凈化，測定抑霉唑含量，計算回收率見表1。紅毛丹肉抑霉唑添加回收率在86.4%～102.3%，RSD(n=3)為1.5%～2.87%，紅毛丹皮抑霉唑添加回收率在88.9%～104.5%，RSD(n=3)為0.84%～1.46%，方法的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差達到滿意結(jié)果。在選定的色譜條件下，質(zhì)量濃度40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)測定5次，保留時間和峰面積的RSD分別為0.15%和2.68%(n=5)。因此，本方法具有很高的靈敏度與精密度，重復(fù)性好，回收率穩(wěn)定，可以為紅毛丹樣品中抑霉唑的測定提供參考方法。運用本實驗建立的方法對實驗所得的上百個紅毛丹樣品進行測定，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

表1 回收率及精密度(n=3)Table 1 Recovery rates and RSDs of imazalil in rambutan peel and flesh (n=3)

2.6 樣品測定

對樣品中紅毛丹肉和紅毛丹皮中的抑霉唑含量進行測定，紅毛丹肉中含量2.36mg/kg，紅毛丹皮中含量21.34mg/kg。

2.7 紅毛丹中抑霉唑的降解曲線

從圖2可以看出，在30d內(nèi)，在紅毛丹肉中抑霉唑殘留量隨貯藏時間的推移，呈增加的趨勢，而在紅毛丹皮中呈下降趨勢，表明抑霉唑在不斷地從紅毛丹皮中轉(zhuǎn)移到紅毛丹肉中。第60天(最后一次分析)，抑霉唑殘留量在紅毛丹肉和紅毛丹皮中明顯降低。說明紅毛丹中殘留的抑霉唑隨著貯藏時間的延長逐漸降解。

圖2 抑霉唑在紅毛丹中的殘留動態(tài)曲線Fig.2 Residue dynamic curves of imazalil in rambutan

3 結(jié) 論

本實驗建立紅毛丹中抑霉唑的固相萃取-反相高效液相色譜殘留動態(tài)分析的方法。該方法簡單快速，精密度與靈敏度較高，是一種有效檢測水果采后的儲存過程中抑霉唑含量的有效方法。

[1] 甘伯中, 張文利, 汪建旭, 等. 塑料薄膜包裝花椰菜采后病害癥狀、病原及防治藥物篩選[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 33(1): 79-82.

[2] 付新梅, 張麗靜, 封順, 等. 高效液相色譜法同時測定甜瓜樣品中的抑酶唑和噻菌靈[J]. 分析化學(xué), 2004, 32(3): 329-331.

[3] 楊濤, 艾爾肯·不拉音, 靳智, 等. 反相高效液相色譜法同時測定果蔬中6種防腐殺菌劑[J]. 食品科技, 2008, 33(9): 245-247.

[4] 郭治安, 趙景嬋, 王耀, 等. 殺菌劑中抑霉唑含量的離子對高效液相色分析[J]. 分析化學(xué), 2004, 32(2): 217-220.

[5] FEMANDEZ M, RODRIGUEZ R, PIEO Y, et al. Liquid chromatographic-mass spectrometric determination of post-harvest fungicides in citrus fruits[J]. J Chromatog A, 2001, 912(2): 301-310.

[6] NAVICKIENE S, M L RIBEIRO M L. A simplified method for the gas chromatographic determination of pyrimethanil residues in fruits[J]. J Sep Sci, 2001, 24(6): 470-472.

[7] 潘守奇, 孫軍, 董靜, 等. 氣相色譜法測定水果和蔬菜中異丙威、嘧霉胺、抑霉唑殘留量[J].食品科學(xué), 2008, 29(12): 516-518.

[8] 應(yīng)興華, 徐霞, 閔捷, 等. 離心破乳-氣相色譜法測定黑米中殘留抑酶唑的研究[J]. 分析試驗室, 2009, 28(9): 59-61.

[9] 應(yīng)興華, 徐霞, 陳銘學(xué), 等. 糧谷中抑酶唑殘留的氣相色譜法測定[J].分析測試學(xué)報, 2009, 28(4): 398-402.

[10] NAVICKIENE S, RIBEIROM L. A simple and rapid extraction for gas chromatographic determination of thiabendazole and imazalil residues in lemons[J]. J Braz Chem Soc, 2002, 13(5): 592-596.

[11] 趙其陽, 焦必寧, 王成秋, 等. 氣相色譜法同時測定柑桔中抑霉唑、噻菌靈和嘧霉胺殘留[J]. 現(xiàn)代科學(xué)儀器, 2007(1): 77-79.

[12] 武婷, 劉波, 李楠. 殺菌劑抑霉唑在梨子中殘留動態(tài)分析[J]. 分析試驗室, 2007, 26(9): 81-83.

[13] 靳智, 楊濤, 李明, 等. 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定果蔬中5種防腐殺菌劑[J]. 分析試驗室, 2008, 27(增刊2): 73-75.

[14] NAVALQN A, PRIETO A, ARAUJO L, et al. Determination of pyrimethanil and kresoximmethyl in green groceries by headspace solidphase microex traction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2002, 975(2): 355-360.

[15] CHARLTON A J, JONES A. Determination of imidazole and triazole fungicide residues in honeybees using gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2007, 1141(1): 117-122.

[16] 吳彩梅, 白潔, 賈剛, 等. 高效液相色譜法測定雞蛋中的三聚氰胺[J].食品科學(xué), 2011, 32(8): 212-218.

Residue Dynamic Analysis of Imazalil in Rambutan by RP-HPLC with Solid-Phase Extraction

GAO Zhi-xi1，JIANG Zhong-yuan1，LI Xin-fa1，WU Yan-hong1，MU Qing-song1，AO Ke-hou1，DENG Chuan-yue2
(1. Department of Chemistry, Zunyi Normal College, Zunyi 563002, China；
2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A reversed-phase high performance liquid chromatographic method with solid-phase extraction was proposed for the residue dynamic analysis of imazalil in rambutan. The analyte was separated on a Shim-pack VP-ODS (150 mm × 4.6 mm,5 μm) using a mobile phased composed of a mixture at a volume ratio of 75:25 of methanol and acidic Na2H2PO4 solution approximately at pH 5 (adjusted with 85% phosphoric acid) at a flow rate of 0.85 mL/min, and detected at 229 nm. The injection amount was 20 μL. An excellent linearity of imazalil in the range of 15.0－960.0 μg/L was achieved (r ＝0.9994). The detection limit was 5.0 μg/L. The average spike recovery rates were in the range of 86.4%－104.5% with relative standard deviation of 0.84%－2.87%. The method was fast, simple, and applicable for the determination of imazalil residue in rambutan.

imazalil；solid-phase extraction；RP-HPLC；rambutan

O657.72

A

1002-6630(2012)08-0188-03

2011-05-30

貴州省遵義市科技局項目([2008]26號)；貴州省教育廳自然科學(xué)基金項目([2010]085號)

高智席(1969—)，男，副教授，碩士，研究方向為儀器分析。E-mail：wyhgzx@163.com