陶然 李進 張克 馬世武 姜維 李溢柔 周向軍

特異性細胞免疫反應(yīng)是機體清除感染病毒和變異細胞的主要機制，體內(nèi)特異性細胞免疫反應(yīng)的啟動需要抗原遞呈細胞（antigen?presenting?cells，APC），主要包括樹突狀細胞（dendritic?cells，DC）對抗原的遞呈[1-2]。慢性乙肝患者體內(nèi)針對乙肝病毒（hepatitis?B?virus，HBV）的特異性免疫應(yīng)答低下，DC功能障礙（如捕獲抗原能力下降或成熟受阻等）被認為是主要原因之一[3-5]。本研究探索了用攜帶有HBV核心抗原（hepatitis?B?core?antigen，HBcAg）基因的重組腺病毒 CHB3體外感染DC進行抗原負載的方法和效果，為慢性乙肝患者體內(nèi)免疫反應(yīng)低下提供解決方案。

材料和方法

一、實驗材料

1.研究標本：健康志愿者，知情告知并簽署知情同意書，肝素鈉抗凝管抽取外周靜脈血50?ml。

2.主要試劑：淋巴細胞分離液（美國Hyclone公司）；GM-CSF、IL-4、Cocktail、IL-2(美國PeproTech公司)；1640培養(yǎng)液，AIM-V培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司）；PAA淋巴細胞培養(yǎng)液（德國PAA公司）；CD86-?FITC、CD83-?PE、CD80-?PEcy5、HLA-DRFITC、CD14-APC、CCR7-PE、FITC羊抗鼠熒光二抗（美國BD公司）；HBcAg-pentamer-PE檢測試劑（美國Proimmune公司）。

二、實驗方法

1.外周血單個核細胞（peripheral?blood?mononuclear?cells，PBMC）的分離及 DC 的體外培養(yǎng)：700?×g離心 20?min 分離血漿，剩余血應(yīng)用磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffer?saline，PBS）1:3稀釋后，淋巴細胞分離液分離PBMC，細胞計數(shù)，用RPMI1640基培重懸細胞，調(diào)整細胞密度為 5?×?106個 /ml，接種于 24 孔板中，每孔接種1?ml，然后置于 37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，1.5?h后，在超凈工作臺內(nèi)，吸除未貼壁細胞，并應(yīng)用無菌杜氏磷酸緩沖液（dulbecco's?phosphate?buffered?saline，DPBS）液洗滌細胞 3 次，最后加入 rhGM-CSF(?800?U/ml）、rhIL-4(?400?U/ml）、青霉素 100?U/ml、鏈霉素 100?U/ml，并分別用 2﹪ 自體血漿（autologous?plasma，AP）的 RPMI1640 完全培養(yǎng)基（或 AIM-V）0.5?ml，37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。10?h后，吸除上清，并用RPMI1640基培洗滌細胞3次，最后應(yīng)用上述加入細胞因子、抗生素和含有?2﹪AP的RPMI1640完全培養(yǎng)基（或AIM-V）1?ml，37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的第3、5天半量換液。

2.重組腺病毒載體感染DC：為研究重組腺病毒載體能否感染DC并介導外源抗原在DC中的表達，選取健康志愿者2例，分離PBMC誘導培養(yǎng)DC。選用攜帶HBV核心抗原的腺病毒載體CHB3以不同的滴度感染第6天DC，感染劑量分別為5?MOI、10?MOI、20?MOI、40?MOI。 感染24?h后，收集感染細胞裂解后取上清進行免疫分析儀檢測（圖1）。其中陽性對照組為20 μg/ml HBcAg 蛋白，陰性對照組為 Ad-GFP?40?MOI感染組。

為研究HFP3對重組腺病毒感染DC細胞效率的影響，選用攜帶綠色熒光蛋白（green?fluorescent protein，GFP）的腺病毒載體Ad-GFP以不同的滴度感染DC，感染劑量分別為2.5?MOI、5?MOI、10?MOI、20?MOI，分為 2 組，一組不加HFP3；另一組加入HFP3 50 μmol/L。感染24?h后，用熒光顯微鏡觀察GFP蛋白的表達，并用流式細胞儀分析GFP陽性細胞比例（圖2）。

圖1 選用攜帶HBV核心抗原的腺病毒載體?CHB3?以不同的滴度感染第6天DC，感染劑量分別為?5?MOI、10?MOI、20?MOI、40?MOI。感染24?h后，收集感染細胞裂解上清進行免疫分析儀檢測。其中陽性對照組為20μg/ml HBcAg蛋白，陰性對照組為?Ad-GFP?40?MOI感染組。結(jié)果顯示在空載病毒?Ad-GFP?感染的?DC?中未檢測到HBcAg?蛋白的表達，但在?CHB3?感染的?DC?中檢測到?HBcAg?的高效表達，其表達水平隨感染劑量的增加而提高

圖2 選用攜帶?GFP?的腺病毒載體?Ad-GFP以不同的滴度感染?DC，感染劑量分別為2.5?MOI、5?MOI、10?MOI、20?MOI，分為?2?組，一組不加?HFP3；另一組加入 HFP3 50 μmol/L。圖a為感染?24?h后，用熒光顯微鏡觀察?GFP?蛋白的表達（×100），圖b為用流式細胞儀分析GFP?陽性細胞比例。結(jié)果顯示加入?HFP3感染組，感染效率約提高?3～?10?倍。

3.目的基因的表達檢測：（1）熒光顯微鏡下觀察Ad-GFP表達，Ad-GFP感染DC24?h后，倒置熒光顯微鏡（Nikon，ELIPSE?Ti）拍照記錄。（2）Elisa法檢查培養(yǎng)上清中的乙肝核心抗原，CHB3腺病毒感染 DC?24?h后，收獲 DC，用 PBS洗 3次，凍融法裂解細胞，離心取上清，用雅培免疫分析儀檢測細胞裂解上清中核心抗原含量。（3）ICS法檢測DC內(nèi)乙肝核心抗原，CHB3腺病毒感染DC?24?h后，收獲DC，用PBS洗2次，用流式胞內(nèi)間接染色法染色，一抗為鼠抗人HBcAg單抗，二抗為羊抗鼠IgG-FITC。

4.DC表面標志檢測：為了研究腺病毒載體感染對DC分化發(fā)育的影響，選取健康志愿者6例，分離PBMC誘導培養(yǎng)DC。用CHB3病毒感染iDC，培養(yǎng)?24?h 后收集細胞，取 1?×?106個細胞置于流式檢測管中，1?ml?PBS離心洗滌細胞2次，加入流式單克隆抗體CD83-PE、CD86-FITC和CD80-PEcy5（或 CCR7-PE、CD14-APC、HLADR-FITC）各10μl，并設(shè)同型對照，4℃避光孵育30?min；1?ml的 PBS 溶液離心洗滌 2 次，加入 2﹪多聚甲醛 100 μl重懸細胞并固定 20?min，流式細胞儀分析 CD14、CD80、CD83、CD86、CCR7和HLA-DR的表達（圖3）。

圖3 ?CHB3病毒載體CHB3感染DC流式檢測結(jié)果

5.五聚體檢測：（1）選取2例HLA-A2陽性、HBV表面抗體和核心抗體陽性的健康志愿者，用優(yōu)化方案培養(yǎng)DC進行CHB3負載，感染的DC用Cocktail促成熟。（2）淋巴細胞用培養(yǎng)液以 2?×?106個 /ml? 的濃度重懸。220?×g離心8??min，收集正常培養(yǎng)的DC和感染后的DC，用培養(yǎng)液將其以 2?×?105DC/ml? 的濃度重懸。將DC?1?ml/ 孔（2?×?105個 / 孔）加入 12 孔板中，再加入 1?ml/ 孔的淋巴細胞（2?×?106個 / 孔），即 DC和淋巴細胞的比例為1:10。將共培養(yǎng)的細胞放入CO2培養(yǎng)箱中，按要求的時間收集細胞進行五聚體檢測。（3）收細胞，每管（1～?2?）×?106個細胞，每份樣品共 2 管。用 PBS?2?ml洗滌 (600?×g離心5?min)1次，在倒掉廢液前檢查是否有細胞沉淀塊。收集洗滌的細胞至新的離心管中，分別加10 μl Pentamer或于1管中混合，在22℃避光孵育 10?min；用 PBS?2?ml?洗滌 1 次細胞，600?×?g,離心 5?min，棄上清；2 管均加入 3～5 μl CD8-APC，4℃避光孵育 20?min；再用 PBS?2?ml?洗滌1次，棄上清；重懸于200μl 2﹪多聚甲醛，流式細胞儀檢測。CD8-APC單染管為對應(yīng)的同型對照。流式檢測時收集細胞數(shù)為 (1～?2)×105個，用美國BD公司的Cell?Quest軟件進行分析。HBV特異性 CTL?細胞的陽性率 (﹪)?=?penta+CD8+/?CD8+×?100﹪。

三、統(tǒng)計學分析方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，采用不同時間iDC的分子表達差異，以P

結(jié)??果

一、細胞形態(tài)圖

DC 體外培養(yǎng) 5～?7?d 時，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞明顯增大（圖4），未成熟DC為半貼壁狀態(tài)，細胞圓而透亮，表面有細小軸突，大部分為單個，少數(shù)聚集成簇。加入抗原刺激4?h后，細胞伸長貼壁，胞質(zhì)向外延伸，聚集形成集落。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC形態(tài)不同。

二、重組腺病毒載體感染DC

在空載病毒Ad-GFP感染的DC中未檢測到HBcAg蛋白的表達，但在CHB3感染的DC中檢測到HBcAg的高效表達，其表達水平甚至比陽性對照組更高，并在一定范圍內(nèi)與病毒滴度呈正比。

三、HFP3對重組腺病毒感染DC效率的影響

表1 ??不同HFP3劑量梯度對重組腺病毒感染DC效率的影響(﹪)

加入HFP3輔助腺病毒感染DC，感染效率約提高3～?10倍。為研究病毒劑量和HFP3的最佳用量，以不同 CHB3 梯度（40?MOI、60?MOI、80?MOI）及不同 HFP3 梯度（25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）組合分別感染 DC，感染24?h后，收集DC，用流式胞內(nèi)間接染色法檢測DC胞內(nèi)HBcAg蛋白的表達（表1）。經(jīng)雙變量F檢驗分析，感染效率與CHB3-MOI差異有統(tǒng)計學意義（P=?0.0002），感染效率與 HFP3 濃度差異有統(tǒng)計學意義（P=?0.0004）。結(jié)果表明，感染效率在一定范圍內(nèi)與病毒滴度MOI和HFP3用量呈正比。綜合最佳DC培養(yǎng)方案和最佳HFP3濃度，檢測腺病毒CHB3對DC的感染效率和感染后DC活細胞比例均可達80﹪以上（圖5）。

圖4 光學顯微鏡下觀察抗原刺激前后DC細胞形態(tài)?

四、腺病毒負載DC表面標志檢測

CD14各組均為陰性顯示各組DC均已從單核成功分化。腺病毒載體CHB3感染能活化iDC，使得iDC的CD80、CD86和CCR7分子的表達上調(diào)但差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.209、0.430、0.054),CD83和HLA-DR的表達不受腺病毒載體影響。為了進一步闡述感染DC的功能狀態(tài)，研究了這些細胞對Cocktail刺激的應(yīng)答情況[6]。iDC感染后加Cocktail?促成熟24?h后進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cocktail刺激能誘導感染DC的成熟，具體表現(xiàn)為CD80、CD83、CD86和CCR7分子的顯著上調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計學意義 (P=0.0019、0.017、0.021、0.0016)。

圖5 不同CHB3梯度下對DC的感染效率與活細胞比例

五、腺病毒CHB3載體負載的DC誘導HBcAg特異性CTL

以自體非貼壁PBMC細胞為對照，這類志愿者的PBMC內(nèi)有HBcAg特異性CTL的本底水平分別為0.25﹪和0.19﹪，經(jīng)過CHB3負載的DC體外刺激僅1周后，HBcAg特異性CTL的水平顯著上調(diào) 7～?8 倍，分別為 1.98﹪ 和 1.37﹪( 圖6)。

圖6 病毒CHB3負載DC誘導HBcAg特異性CTL流式細胞圖

討 論

我國是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，目前HBsAg攜帶率達7.18﹪，超過1.1億人，需要進行抗病毒治療的慢性乙型肝炎（chronic?hepatitis?B,?CHB）患者約為2000萬，其中25﹪～?40﹪可發(fā)展為肝硬化和肝癌，每年約70萬人死于乙肝相關(guān)并發(fā)癥，包括肝硬化、肝癌，HBV感染嚴重威脅著人民的生命健康。目前尚無根治HBV感染的藥物，現(xiàn)有的治療藥物存在復發(fā)率高，耐藥或有效率較低的局限性。因此，臨床上迫切需要探索新的治療方法，以解決目前抗病毒治療過程中存在的問題。

盡管CHB的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，但現(xiàn)有的證據(jù)表明：影響HBV的致病并不完全依賴于病毒本身[7]，宿主對HBV的免疫反應(yīng)可能在致病因素中起到了重要的作用[8]。急性HBV感染者，機體針對HBV會產(chǎn)生強烈的多特異性免疫反應(yīng)，而慢性HBV感染者則出現(xiàn)弱的免疫反應(yīng)[9]。Chisari等[10]通過HBV轉(zhuǎn)基因鼠模型研究發(fā)現(xiàn)：HBV抗原誘導的細胞免疫應(yīng)答對于清除細胞內(nèi)的HBV發(fā)揮重要的作用，作為“雙刃劍”，它也參與了HBV感染引起肝細胞炎癥損傷的過程。在清除HBV的過程中，包括溶胞機制及非溶胞機制，而且非溶胞機制中IFN-γ，TNF等細胞因子起到主要作用，可以縮短乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA的半衰期，從而達到抑制HBV?DNA復制的目的。而慢性乙肝患者體內(nèi)CTL功能減弱是導致乙肝慢性化的關(guān)鍵性因素，CTL的功能恢復是免疫治療CHB的重要目標。因此，除了應(yīng)用抗病毒治療外，增加針對HBV的自身免疫細胞數(shù)量，進行免疫重建是一條治療CHB的新思路。

本研究以DC作為切入點，探索了用攜帶有HBcAg基因的重組腺病毒在體外感染DC，將HBcAg基因帶入DC內(nèi)表達，使內(nèi)源性HBcAg經(jīng)DC加工遞呈，從而誘導HBV特異性CTL反應(yīng)的可行性。

DC作為已分化的、有絲分裂后期的免疫細胞，難以轉(zhuǎn)染外源基因，常規(guī)方法往往轉(zhuǎn)染效率低下。腺病毒載體能夠轉(zhuǎn)染這類非分裂細胞，但需要很高的病毒劑量，轉(zhuǎn)染達到100?MOI～?1000?MOI以上。Naoki等[11]的研究結(jié)果顯示腺病毒的離心感染法能在一定程度上提高DC的感染效率，但研究表明，較高的腺病毒感染劑量或長時間離心操作都會嚴重影響DC活性（結(jié)果未顯示）。為了探索一種優(yōu)化的腺病毒載體感染DC的方法，既能用較低的病毒劑量獲得較高的感染效率，又不影響DC活性，引入了一種新的HFP3短肽輔助感染，結(jié)果表明HFP3能顯著提高腺病毒載體負載DC的效率3～?10倍，感染效率在一定范圍內(nèi)與HFP3用量呈正比。采用優(yōu)化的HFP3感染方案，腺病毒CHB3對DC的感染效率可達到80﹪～?90﹪以上；腺病毒載體CHB3的感染能活化未成熟DC，使得未成熟DC的CD80、CD86和CCR7分子的表達上調(diào)。

重組腺病毒負載的DC與PBMC共孵育后，應(yīng)用五聚體檢測發(fā)現(xiàn)：這2例志愿者均可以誘導出針對HBcAg18–27肽特異性的CTL，與PBMC相比明顯升高。重組腺病毒的DC體外誘導T細胞生成針對HBcAg肽特異性的CTL，這是非常重要的。對于CHB患者，若應(yīng)用DC疫苗直接注射方法可能會誘導體內(nèi)PBMC生成針對HBV的CTL，或者采用體外進行免疫功能重建并回輸給患者，可能會起到清除HBV的目的。目前僅得到的是初步結(jié)果，今后的工作還應(yīng)擴大樣本量，并體外檢測HBV感染自然史的不同階段，DC疫苗是否也會誘導出針對HBV的特異性CTL。

DC疫苗是目前最具開發(fā)潛力的疫苗之一，國外已有200多項DC疫苗臨床研究方案在進行中。在2011年荷蘭召開的國際細胞治療年會（ISCT年會）上，DC被廣泛認為是一種安全而有效的細胞免疫治療方法。本研究系統(tǒng)地比較了腺病毒載體CHB3的抗原負載對DC表型功能的影響以及感染DC體外激活抗原特異性CTL的能力。這些結(jié)果更好地刻畫了腺病毒載體介導的DC抗原負載條件，為DC細胞的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1?Kawakami?Y,?Fujita?T,?Kudo?C,?et?al.?Dendritic?cell?based?personalized?immunotherapy?based?on?cancer?antigen?research[J].?Front?Biosci,?2008,?13:?1952-1958.

2?Xu?H,?Cao?X.?Dendritic?cell?vaccines?in?cancer?immunotherapy:?from?biology?to?translational?medicine[J].?Front?Med,?2011,?5(4):323-332.

3?Rodrigue-Gervais?IG,?Rigsby?H,?Jouan?L,?et?al.?Dendritic?cell?inhibition?is?connected?to?exhaustion?of?CD8+T?cell?polyfunctionality?during?chronic?hepatitis?C?virus?infection[J].?J?Immunol,?2010,?184(6):3134-3144.

4?Arima?S,?Akbar?SM,?Michitaka?K,?et?al.?Impaired?function?of?antigen-presenting?dendritic?cells?in?patients?with?chronic?hepatitis?B：localization?of?HBV?DNA?and?HBV?RNA?in?blood?DC?by?in?situ?hybridization[J].?Int?J?Mol?Med,?2003,?11(2):?169-174.

5?Van?der?Molen?RG,?Sprengers?D,?Binda?RS,?et?al.?Functional?impairment?of?myeloid?and?plasmacytoid?dendritic?cells?of?patients?with?chronic?hepatitis?B[J].?Hepatology,?2004,?40(3):738-746.

6?Helmut?J,?Ulrich?K,?Gabriele?M,?et?al.?Pro-inflammatory?cytokines?and?prostaglandins?induce?maturation?of?potent?immunostimulatory?dendritic?cells?under?fetal?calf?serumfree?conditions[J].?Eur.?J.?Immunol,?1997,?27:?3135-3142.

7?Fattovich?G.?Natural?history?and?prognosis?of?hepatitis?B[J].?Semin?Liver?Dis,?2003,?23(1):?47-58.

8?Stanislas?P,?Bertrand?N?,?Fran?oise?D,?et?al.?Efficacy?and?limitations of a specific immunotherapy in chronic hepatitis B[J].?J?Hepatol,?2001,?34(6):?917-921.

9?Chang?JJ,?Lewin?SR.?Immunopathogenesis?of?hepatitis?B?virus?infection[J].?Immunol?Cell?Biol,?2007,85(1):16-23.

10?Guidotti?LG,?Chisari?FV.?Noncytolytic?control?of?viral?infections?by?the?innate?and?adaptive?immune?response[J].?Annu?Rev?Immunol,?2001,?19:?65-91.

11?Naoki?N,?Yasuhiko?N,?Tsutomu?S,?et?al.?Novel?centrifugal?method?for?simple?and?highly?efficient?adenovirusmediated?green?fluorescence?protein?gene?transduction?into?human?monocyte-derived?dendritic?cells[J].?Journal?of?ImmunologicalMethods,?2001,?253:1