邵麗媛 劉麗華 楊青 盧雪紅 于宏宇

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在維持免疫耐受中發(fā)揮重要的作用，通過(guò)甲強(qiáng)龍治療狼瘡腎炎模型，觀察狼瘡腎炎小鼠狼瘡癥狀、Treg數(shù)量和功能基因的變化，闡明中樞和外周耐受機(jī)制的異常如何參與狼瘡腎炎的發(fā)生，從而為狼瘡腎炎治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡(BALB/C×C57BL/6)F1(H-2d/b)代雜交鼠18只(雌性9只，雄性9只)體重(18±2)g，隨機(jī)分為模型組12只和對(duì)照組6只(每組雌雄各半)。

1.1.2 試劑及儀器 FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品?？购丝贵w試劑盒為德國(guó)歐蒙公司產(chǎn)品。尿蛋白試紙為廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。FITC標(biāo)記的抗小鼠CD25單克隆抗體 mAb(FITC-抗CD25 mAb)及PE標(biāo)記的抗小鼠CD4 mAb(PE-抗CD4 mAb)為英國(guó)B.D.公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)為美國(guó)BECTON DICKINSON產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠模型的建立 采用慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的方法［1］誘導(dǎo)狼瘡腎炎小鼠模型。免疫4周后模型成功，末次免疫2周后模型組分為未治療組和激素治療組(每組6只，雌雄各半)，治療組每日腹腔注射甲強(qiáng)龍(40 mg/kg)，未治療組及對(duì)照組給予相應(yīng)的生理鹽水，療程8周。

1.2.2 Treg數(shù)量的檢測(cè) 胸腺、脾臟組織制備細(xì)胞懸液，取1×106個(gè)細(xì)胞用200μL的 PBS混懸，加 2μL FITC-抗 CD25 mAb和5μL PE-抗 CD4 mAb，置冰浴中 30 min，以 PBS 洗 1次。經(jīng)500μL 20 g/L多聚甲醛固定后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 Treg功能基因的檢測(cè) cDNA的逆轉(zhuǎn)錄采用Takara的AMV RTase，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。PCR引物名稱(chēng)、序列、產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

1.2.4 尿蛋白的檢測(cè) 用尿蛋白試紙蘸取小鼠尿液，與標(biāo)準(zhǔn)尿液分析試紙條的顏色進(jìn)行比較，結(jié)果以“-”“+﹑++﹑+++﹑++++”表示。

1.2.5 抗核抗體的檢測(cè) 采用間接免疫熒光法:按試劑盒說(shuō)明操作，熒光二抗為FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6 小鼠腎臟病理 小鼠脫臼處死，取腎臟，留取部分新鮮組織冰凍切片，采用直接免疫熒光法檢測(cè)腎臟免疫復(fù)合物。另外留取腎皮質(zhì)，用100 ml/L甲醛固定后，按常規(guī)進(jìn)行HE、PAS、PAM、Masson染色，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組小鼠末次免疫3周后逐漸出現(xiàn)脫毛，尿蛋白增多，并且尿蛋白逐漸增多，從末次誘導(dǎo)到3個(gè)月時(shí)模型未治療組++(2只)，+++(4只)，模型治療組+(3只)，±(3只);而對(duì)照組為±(2只)，-(4只)。

2.2 血清抗核抗體(ANA) 結(jié)果顯示對(duì)照組均為陰性;模型未治療組ANA滴度為1:640(2只)，1:1000(4只)，模型治療組ANA滴度為1:100(3只)，1:320(3只)，見(jiàn)圖1。

2.3 小鼠腎臟病理變化 免疫熒光結(jié)果:對(duì)照組均為陰性，模型未治療組腎小球血管袢和系膜區(qū)有IgG沉積，模型治療組熒光減弱，見(jiàn)圖2。光鏡下對(duì)照組小鼠腎臟病理正常，模型治療組較模型未治療組病理明顯減輕。

2.4 各組小鼠胸腺、脾臟中CD4+CD25+Tr/CD4+T的變化見(jiàn)表2。

2.5 各組小鼠胸腺、脾臟中CD4+CD25+Tr功能基因的變化見(jiàn)表3。

圖1 各組小鼠ANA的變化

圖2 各組小鼠腎臟免疫熒光的變化

表1 β-actin，CTLA-4，F(xiàn)oxp3引物序列

表2 各組CD4+CD25+Tr/CD4+T的變化

表3 各組小鼠CD4+CD25+Tr 功能基因的變化

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見(jiàn)多因性自身免疫病，病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。我們采用親代BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞輸入(C57BL/6×BALB/c)F1代小鼠產(chǎn)生了cGVHD，表現(xiàn)為脫毛，蛋白尿等癥狀，免疫學(xué)異常表現(xiàn)為血清中高滴度的抗核抗體，腎臟可見(jiàn)免疫復(fù)合物沉積。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明本實(shí)驗(yàn)所用的cGVHD誘導(dǎo)狼瘡樣小鼠的方法是可行的，并且狼瘡樣小鼠全部處于發(fā)病狀態(tài)。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的Treg具有免疫抑制作用，能抑制多種自身免疫病的發(fā)生，包括Ⅰ型糖尿?。?］、實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎、炎性腸病等。但Treg在炎癥性自身免疫病(包括SLE等)中的作用還存在爭(zhēng)議。本研究的結(jié)果顯示cGVHD小鼠胸腺、脾臟中的Treg在數(shù)量上無(wú)明顯差別。

Foxp3 是 CD4+CD25+Tr［3］發(fā)育和行使功能的必需轉(zhuǎn)錄因子，除Foxp3外，Treg表面表達(dá)一種重要的膜分子:細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4，CD152)。CTLA-4是淋巴細(xì)胞表面的一種與免疫信號(hào)傳遞有關(guān)的配體蛋白分子［4］，它屬于免疫球蛋白超家族成員，為Ⅰ型膜蛋白分子。CTLA-4與B7結(jié)合后，負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，可減緩細(xì)胞周期的進(jìn)程，降低IL-2的產(chǎn)生，使T細(xì)胞活化增殖受到抑制，從而使免疫達(dá)到平衡狀態(tài)，保持外周的免疫平衡。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示cGVHD小鼠糖皮質(zhì)激素治療后SLE模型鼠中樞外周耐受異常有明顯的恢復(fù)，胸腺和脾臟Treg產(chǎn)生數(shù)量雖無(wú)增加但功能基因Foxp3增強(qiáng)可能為SLE全身癥狀和臟器損傷恢復(fù)(腎臟好轉(zhuǎn))的原因之一。激素治療后Treg的功能增強(qiáng)，而T細(xì)胞活化基因CTLA-4明顯受抑制，由此可見(jiàn)提升Treg功能而抑制T細(xì)胞活化，可能為狼瘡性腎炎新的治療靶點(diǎn)。

［1］ 盧雪紅，彭歆，李一，等.慢性移植物抗宿主病狼瘡小鼠模型的建立和淋巴細(xì)胞功能的變化.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2008，12(9):1047-1049.

［2］ Kukreja A，CostG，Marker J，et al.Multiple immuno-regulatory defects in type1 diabetes.J Clin Invest，2002，109(1):131-140.

［3］ Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25):breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.J Immunol，1995，155:1151-1164.

［4］ David MS，Lucy SK，Walke R.The role of CD28 and cytotoxic T lymphocyte antigen(CTLA-4)in regulatory T cell biology.J Immunol Rev，2006，21(2):131-148.