郝胤博，吳學(xué)志，羅麗萍，郭夏麗，張 茜，戴喜末，陳 濱

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031)

中國不同地區(qū)蜂膠水提物的抑菌活性

郝胤博，吳學(xué)志，羅麗萍*，郭夏麗，張 茜，戴喜末，陳 濱

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031)

為明確中國蜂膠水提物的抑菌活性，本文采用瓊脂擴(kuò)散法和微量液體稀釋法，分別測定了來自中國26個地區(qū)的蜂膠水提物(Water Extraction of Propolis，WEP)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌和毛霉的抑菌圈和最小抑菌濃度。結(jié)果表明:除云南西雙版納WEP外，其余WEP均對受試菌表現(xiàn)出一定的抑菌性。西南地區(qū)WEP對金黃色葡萄球菌抑菌性最強(qiáng)，東北地區(qū)WEP對毛霉抑菌性最強(qiáng)，華東地區(qū)WEP對大腸桿菌、變形桿菌和產(chǎn)氣桿菌抑菌性均最強(qiáng)。中國蜂膠水提物具有一定的抑菌活性，對5種受試菌抑制程度由大到小為:金黃色葡萄球菌(6.71± 2.97)mm＞變形桿菌(6.48±2.89)mm＞產(chǎn)氣桿菌(6.3±2.78)mm＞毛霉(3.57±3.38)mm＞大腸桿菌(2.18±3.36)mm。

蜂膠，水提物，抑菌作用，瓊脂擴(kuò)散法，微量液體稀釋法

蜂膠(Propolis)是西方蜜蜂采集植物樹芽、樹皮等部位的樹脂，再混以蜜蜂舌腺、蠟腺等腺體的分泌物，經(jīng)加工轉(zhuǎn)化而形成的一種膠狀物質(zhì)。蜂膠富含多酚及類黃酮等活性物質(zhì)［1－3］，在西方一直作為民間藥物使用。由于蜂膠的多數(shù)有效成分容易被醇提取，所以關(guān)于蜂膠醇提物的研究報道很多［4］。對中國不同地區(qū)蜂膠醇提物的抑菌性研究報道表明，蜂膠醇提物對真菌的抑菌性最強(qiáng)，革蘭氏陽性菌次之，對革蘭氏陰性菌最弱［5］。與醇提物相比，對蜂膠水提物(Water Extraction of Propolis，WEP)的研究報道較少，且多集中在對巴西蜂膠的研究上。巴西綠蜂膠用水可以得到更充分的提取。WEP中含有大量的酚酸類化合物，中國不同地區(qū)WEP中的酚類化合物化學(xué)成分差異明顯［6］。Matsui研究表明，巴西WEP比醇提物有更好的抗氧化活性，可以更好地抑制一些酶的活性［7］。Arjun發(fā)現(xiàn)巴西和中國WEP比醇提物具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力(但具體中國哪個地區(qū)蜂膠未知)，與之相反，秘魯蜂膠和荷蘭蜂膠則是醇提物強(qiáng)于WEP［8］。WEP對化學(xué)和免疫學(xué)肝損傷模型都有保肝作用，并具有抗血小板凝結(jié)、抗炎、保護(hù)視神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗菌等活性［9－11］。WEP還可以避免醇提液產(chǎn)生的副作用［12］，具有很好的應(yīng)用前景。但目前尚沒有關(guān)于中國蜂膠水提物的抑菌活性的報道。課題采集了來自中國26個不同地區(qū)的蜂膠樣品，經(jīng)水提分別獲得其WEP，以4種細(xì)菌和1種真菌為受試菌種，采用瓊脂擴(kuò)散法和微量液體稀釋法對比研究了WEP的抑菌圈大小和最小抑菌濃度，為中國蜂膠的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂膠原膠 26個蜂膠樣品分別來自中國19個省份，以采集省份的拼音縮寫作為樣品代碼［13］;蜂膠原膠置于－18℃，變硬變脆后打成小碎塊，去除雜質(zhì)，用藥材粉碎機(jī)粉碎，過40目篩后放于冰箱中備用;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變 形 桿 菌 (Proteusbacillus vulgaris)、產(chǎn)氣桿菌(Clostridium perfringens)、毛霉(Mucor racemosus) 均由南昌大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氯化鈉、葡萄糖 分析純;瓊脂。

涂布棒，接種針，酒精燈，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 WEP的制備 WEP的制備方法［3］:取4.0g蜂膠，在120mL蒸餾水中混勻，在60℃下水浴提取7h。提取液離心30min，收集上清液。殘?jiān)谕瑯訔l件下再提取1次。合并提取液，于60℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到固態(tài)WEP。使用時用蒸餾水復(fù)溶，配制成所需濃度待用。

1.2.2 抑菌圈的測定［1］采用瓊脂擴(kuò)散法:取直徑5mm的圓形濾紙放入培養(yǎng)皿中，121℃高壓蒸汽滅菌30min，烘干。將無菌濾紙片分別浸于的15mg/mL的WEP中。配制濃度為1.5×108cfu/mL的菌懸液，用5.0麥?zhǔn)媳葷岱ㄐＵ?。?00μL各菌種懸濁液分別加入到固體培養(yǎng)基上，用三角涂棒涂布均勻，細(xì)菌使用肉湯培養(yǎng)基，真菌使用真菌培養(yǎng)基。將浸好的濾紙片用鑷子輕貼于平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)24h，真菌培養(yǎng)48h后，用游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌圈直徑。每個實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個平行重復(fù)。

1.2.3 最小抑菌濃度的測定［14］采用微量液體稀釋法:使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用無菌吸管吸取普通肉湯培養(yǎng)基和WEP(50mg/mL)各0.2mL，先在第一個孔混勻，再吸出0.1mL混勻液放入第二個孔中，加0.1mL普通肉湯混勻，再從第二個孔吸出0.1mL混勻液放入第三個孔中，加0.1mL普通肉湯混勻，以此類推，得到10個WEP濃度梯度的普通肉湯液體培養(yǎng)基(毛霉使用沙保羅氏液體培養(yǎng)基)，然后在每孔中分別加入0.1mL濃度為1.5×108cfu/mL的菌懸液，混合均勻，將培養(yǎng)板放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)24h，真菌培養(yǎng)48h，觀察實(shí)驗(yàn)菌生長情況，以不長菌的最小WEP濃度(mg/mL)為最小抑菌濃度。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 對于兩組以上的均數(shù)比較，使用方差分析的方法最為適合，過程中進(jìn)行單因素方差分析，所以課題采用SPSS v17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著;大寫字母代表在0.01水平下比較，差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

表1 中國不同地區(qū)蜂膠水提物對5種受試菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 The inhibition zone diameter of the water extract of propolis from different areas of China(mm)

表2 中國不同地區(qū)蜂膠水提物對5種受試菌的最小抑菌濃度(mg/g)Table 2 Theminimum inhibitory concentration of water extraction of propolis from different areas of China(mg/g)

由中國不同地區(qū)WEP的抑菌圈(表1)和最小抑菌濃度(表2)的測定結(jié)果可知，除西雙版納WEP對所有受試菌種均不表現(xiàn)抑菌作用外，其余WEP均具有一定的抑菌作用，不同地區(qū)WEP抑菌作用有明顯的差異。WEP對金黃色葡萄球菌都有明顯的抑菌作用，大部分 WEP對大腸桿菌也有抑制作用，各地WEP對變形桿菌和毛霉的抑菌作用不顯著。通過抑菌圈和最小抑菌濃度大小分析可知，抑菌圈越大，抑菌性越強(qiáng)，最小抑菌濃度越小，兩者呈負(fù)相關(guān)性，WEP對5種受試菌種的抑菌程度由大到小是:金黃色葡萄球菌(6.71±2.97)mm＞變形桿菌(6.48± 2.89)mm＞產(chǎn)氣桿菌(6.30±2.78)mm＞毛霉(3.57± 3.38)mm＞大腸桿菌(2.18±3.36)mm。將蜂膠按地理來源分類，各地區(qū)WEP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌和毛霉的抑菌性差異均顯著(P＜0.05)，西南地區(qū)WEP對金黃色葡萄球菌抑菌性最強(qiáng)，東北地區(qū)WEP對毛霉抑菌性最強(qiáng)，華東地區(qū)WEP對大腸桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌抑菌性均最強(qiáng)。

Supawadee［15］等研究了臺灣WEP的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌比大腸桿菌對WEP更敏感，黑曲霉的敏感性最弱，和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。Kedzia等［16］研究報道:蜂膠抑菌性是由黃酮類、酚酸類和倍半萜類物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，單一提取物成分的抑菌活性低于總提取物［17］。蜂膠醇提物抑菌作用的研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性菌對蜂膠醇提物的敏感性高于革蘭氏陰性菌［18］，Tegos［19］認(rèn)為革蘭氏陰性菌對蜂膠的敏感性較弱有2個原因:一是革蘭氏陰性菌的外膜有抑制、延緩低濃度蜂膠提取液滲透的作用;二是革蘭氏陰性菌存在可以將蜂膠提取液進(jìn)行外排的物質(zhì)。

3 結(jié)論

中國WEP有一定的抑菌作用，不同地區(qū)WEP抑菌作用有明顯的差異。云南西雙版納蜂膠對受試菌種均沒有表現(xiàn)出抑菌作用;革蘭氏陽性菌對WEP的敏感性高于革蘭氏陰性菌;WEP各單種化學(xué)成分同抑菌作用沒有顯著相關(guān)性，說明WEP表現(xiàn)出的抑菌作用是WEP中多類物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果中國蜂膠水提物仍然具有一定的利用價值。目前蜂膠的利用方式大多為醇提取，會造成部分有效成分的損失。由于天然優(yōu)質(zhì)蜂膠資源在我國非常稀缺，要充分利用這一珍貴資源，提高其利用率，而且可以對其WEP進(jìn)行提取利用。建議進(jìn)一步開展WEP其他生物活性的研究，以全面了解中國蜂膠，為進(jìn)一步合理利用蜂膠提供理論依據(jù)。

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Antimicrobial activity of water extract of propolis from different areas of China

HAO Yin－bo，WU Xue－zhi，LUO Li－ping*，GUO Xia－li，ZHANG Xi，DAI Xi－mo，CHEN Bin
(School of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China)

In order to identify the antimicrobial activity of water extract of propolis from different areas of China，water extract of propolis(WEP)from 26 areas of China were selected and studied in this paper，agar diffusion method and microdilution broth susceptibility assay were employed to measure the zones of inhibition and the minimum inhibitory concentration of WEP on Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Proteusbacillus vulgaris，Clostridium perfringens，Mucor racemosus，respectively.The results suggested that WEP had antimicrobial activity，except for the WEP from YN－2.The WEP of southwest exhibited the highest antimicrobial activity against S.aureus，WEP of northeast exhibited the highest antimicrobial activity against M.racemosus，and the WEP of east of China exhibited the highest antimicrobial activity against E.coli，P.vulgaris and C.perfringens.WEP of China had some antibacterial activity，the relative order of sensitivity of the 5 different strains from the most to least were S.aureus(6.71±2.97)mm＞P.vulgaris (6.48±2.89)mm＞C.perfringens(6.3±2.78)mm＞M.racemosus(3.57±3.38)mm＞E.coli(2.18±3.36)mm.

propolis;water extract;antimicrobial activity;agar diffusion method;microdilution broth susceptibility assay

TS201.2

A

1002－0306(2012)10－0101－04

2011－07－07 *通訊聯(lián)系人

郝胤博(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:植物資源與系統(tǒng)植物學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(31071551);南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(SKLF－KF－201003)。