李晶博，林蔣海，肖文娟，劉澤寰

(暨南大學(xué)生命與健康工程研究院分子生物研究中心，廣東廣州510632)

蒸汽爆破甘蔗渣中抗氧化物質(zhì)的提取及評價(jià)

李晶博，林蔣海，肖文娟，劉澤寰*

(暨南大學(xué)生命與健康工程研究院分子生物研究中心，廣東廣州510632)

以蒸汽爆破甘蔗渣(SESB)為原料，乙醇、甲醇、水及乙酸乙酯為溶劑，對其中的多酚和糖進(jìn)行提取并評價(jià)了提取液的抗氧化能力。其中甲醇提取液中酚類物質(zhì)含量最高((1.5174±0.0140)mg/mL)，水次之((1.2382±0.0025)mg/ mL)，乙酸乙酯最低。提取液中的總糖含量以水中最多，其次為甲醇，乙酸乙酯中最低。四種提取液對DPPH自由基均具有很強(qiáng)的清除能力。水、乙醇和甲醇提取液具有較強(qiáng)的還原力，呈明顯的量效關(guān)系。采用溶劑對SESB中抗氧化物質(zhì)提取是可行的。綜合經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境問題及水提取液中酚類含量、總糖含量以及抗氧化能力，認(rèn)為以水作為溶劑最佳。

蒸汽爆破甘蔗渣，酚類，總糖，提取，抗氧化能力

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蒸汽爆破甘蔗渣(SESB) 河南省鶴壁市正道重機(jī)廠，蒸汽爆破參數(shù):溫度:220℃;液固比:1∶1;220℃保溫時(shí)間:5min;無水乙醇(AR) 南京化學(xué)試劑廠;乙酸乙酯(AR) 國藥化學(xué)集團(tuán);甲醇(AR) 天津大茂化學(xué)試劑廠;濃硫酸(AR) 北京化工廠;木糖(BR) 上海博澳生物科技有限公司;沒食子酸(AR) 天津光復(fù)精細(xì)化學(xué)研究所;Folin－Ciocalteu試劑 廣州齊云生物技術(shù)有限公司;DPPH 日本東京化成工業(yè)株式會社;實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水;其余試劑 均為分析純。

UNICO UV－2000紫外可見光分光光度計(jì) 尤尼克(上海)儀器有限公司;恒溫水浴鍋 金壇實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠;超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

表1 不同提取液中總糖、酚類含量Table 1 Total sugar and phenolic contents in different extracts

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SESB中酚類物質(zhì)的提取 精確稱取0.5g絕干SESB置于具塞刻度試管中，分別精確加入10mL去離子水、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯溶液，分別于100、80、80、80℃提取10min，然后自來水冷卻，過濾后分別得到水提取液(AE)，乙醇提取液(EE)，甲醇提取液(ME)，乙酸乙酯提取液(EAE)。

1.2.2 Folin－Ciocalteu法測定酚類物質(zhì)測定波長的選擇 準(zhǔn)確稱量0.1g沒食子酸，溶于100mL去離子水中，得到1mg/mL沒食子酸溶液。然后準(zhǔn)確取10mL 1mg/mL沒食子酸溶液，用去離子水定容至100mL，得到0.1mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。取該溶液0.3mL置于10mL比色管中，加去離子水定容至5mL，搖勻，加入0.5mL Folin－Ciocalteu試劑，搖勻后，加入0.75mL 20%的Na2CO3溶液，定容至刻度，同時(shí)做空白管。40℃水浴40min后，在700～900nm范圍內(nèi)測定吸光度，確定最大吸收波長。取一定量的AE溶液，依上法顯色后，在700～900nm范圍內(nèi)測定吸光度。

1.2.3 Folin－Ciocalteu法測定酚類物質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 用刻度吸管精確量取0.1mg/mL沒食子酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，根據(jù)1.2.2方法顯色后，于選定波長下測定其吸光度，得到回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 Folin－Ciocalteu法測定酚類物質(zhì)含量的方法精密度 取等量的AE、EE、ME、EAE，分別測定五次，計(jì)算平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)方差(RSD)。

1.2.5 Folin－Ciocalteu法測定酚類物質(zhì)含量的加樣回收率 取已知量的AE、EE、ME、EAE，分別加入標(biāo)樣40μg，然后測定，計(jì)算回收率和RSD。

1.2.6 提取液中酚類物質(zhì)含量測定 根據(jù)測定結(jié)果利用回歸曲線計(jì)算得到。

1.2.7 DPPH自由基清除率的測定 根據(jù)文獻(xiàn)［6］進(jìn)行測定。IC50表示清除率為50%時(shí)的酚類物質(zhì)含量。

1.2.8 還原力測定 根據(jù)文獻(xiàn)［7］進(jìn)行測定。OD700越高說明還原力越強(qiáng)。

1.2.9 總糖測定 根據(jù)文獻(xiàn)［8］進(jìn)行測定，以木糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，在480nm處進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 Folin-Ciocalteu法測定酚類物質(zhì)含量的方法學(xué)驗(yàn)證

不同文獻(xiàn)報(bào)道的采用Folin－Ciocalteu法測定酚類物質(zhì)所選的波長都不盡相同［9－10］，而且由于不同底物引起的檢測方法適用性差異，本文對 Folin－Ciocalteu法測定SESB不同提取液中的酚類物質(zhì)進(jìn)行了驗(yàn)證。因此在本實(shí)驗(yàn)中，分別對沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品顯色液在不同波長下進(jìn)行了測定，本實(shí)驗(yàn)選擇765nm作為測定波長。Folin－Ciocalteu法測定不同溶劑提取液中酚類物質(zhì)測定的精密度，其RSD值均小于5%，說明采用該方法測定AE、EE、ME、EAE中酚類物質(zhì)具有較高的精密度。采用 Folin－Ciocalteu法測定不同溶劑提取液中酚類物質(zhì)的加樣回收率均在100%±5%之間，說明該方法具有較好的準(zhǔn)確性。加樣回收率之間的RSD均小于5%，說明該法的重現(xiàn)性高(數(shù)據(jù)均未顯示)。

2.2 不同提取液中的總糖、酚類含量

有研究表明，從麥麩中提取的阿魏酸寡聚糖具有一定的抗氧化能力［11］，因此，本實(shí)驗(yàn)對提取液中的總糖進(jìn)行了測定。表1中列出了提取液中的總糖、總酚含量。乙酸乙酯提取液中的總糖低于檢限，而其他三種溶劑中的總糖含量由高到低排列:水、甲醇、乙醇，并且兩兩之間具有顯著性差異，說明用水、甲醇和乙醇作為溶劑提取SESB中抗氧化組分時(shí)，部分糖會溶解于其中。雖然這部分糖由于被提取而會降低同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量，但其脫毒作用以及所得到的抗氧化組分可以彌補(bǔ)其不足，并且提取的糖分有可能為低聚木糖等高附加值產(chǎn)品。

水、乙醇和甲醇提取液中的酚類物質(zhì)含量相差不大，但是乙酸乙酯提取液中酚類物質(zhì)的含量較其他三種溶劑少約10～14倍。雖然很多研究［4，12］采用乙酸乙酯提取酚類物質(zhì)，然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙酸乙酯并不是酚類物質(zhì)的最佳溶劑，這與Goli等［13］的報(bào)道一致。由表1可知，甲醇提取液中酚類物質(zhì)含量最高，其次為水提取液，乙醇提取液次之，乙酸乙酯提取液中酚類物質(zhì)含量最少。

2.3 不同溶劑提取液的DPPH清除能力

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)其與具有自由基清除能力的化合物混合時(shí)，顏色由紫色變?yōu)辄S色，因此，DPPH·作為評價(jià)物質(zhì)自由基清除能力的一種常用自由基而被廣泛應(yīng)用［14］。很多有自由基清除潛力的物質(zhì)都能夠使DPPH自由基褪色，包括溶劑中的雜質(zhì)甚至自身可以作為自由基清除者［15］，因而DPPH測定系統(tǒng)評價(jià)了混合物中總的自由基清除能力。

圖1－A表示了三種不同溶劑提取液在不同體積下的DPPH自由基的清除能力。EE、ME和AE的體積在20μL時(shí)，其DPPH·清除率和加入的提取液體積具有較明顯的線性關(guān)系，R2分別為:0.9707、0.9937、0.9868，說明提取液的DPPH·清除率在小于85%時(shí)具有明顯的量效關(guān)系，當(dāng)提取液的體積超過20μL時(shí)，其DPPH·清除率趨于穩(wěn)定。EE、ME和AE的DPPH·清除能力十分接近，在體積為30μL和40μL時(shí)達(dá)到最大值，90%左右。而乙酸乙酯提取液在25μL時(shí)僅具有22.42%的清除率(圖1－B)。由此可見，對于SESB中抗氧化物質(zhì)的提取，極性較強(qiáng)的溶劑(乙醇、甲醇和水)的提取效果較好，其他研究［13］具有類似的結(jié)果。

圖1 不同溶劑提取液的DPPH·清除率Fig.1 DPPH·scavenging ability of different solvent extracts

IC50是指DPPH自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的酚類物質(zhì)濃度，水、乙醇、甲醇和乙酸乙酯提取液中抗氧化物質(zhì)的 IC50依次為:5.9720、4.4535、6.2373和5.1341mg GAE/L。IC50越高表明此提取液的DPPH·清除能力越差［16］。乙醇提取液的IC50最小，甲醇的最大。說明乙醇提取液中DPPH·清除能力較強(qiáng)的組分較多，而甲醇對于DPPH·清除能力較強(qiáng)的組分溶解能力較差。由于溶液極性的不同，對酚類物質(zhì)中不同組分的溶解能力也不盡相同，不同組分的DPPH·清除能力也不盡相同［17］。

2.4 不同溶劑提取液的還原力

還原力可以作為抗氧化能力的一個(gè)重要反映，還原力高則表明抗氧化能力強(qiáng)［5］。由圖2可以看出，不同體積的提取液均具有較強(qiáng)的還原力，由于乙酸乙酯提取液中酚類含量太低，未對其進(jìn)行檢測。水提取液的還原力較其他兩種提取液的還原力弱(P＜0.05)，而乙醇和甲醇提取液的還原力在20～100μL時(shí)幾乎沒有差異(P＞0.05)。在測定范圍內(nèi)，三種不同提取液均表現(xiàn)出較強(qiáng)的量效關(guān)系，將其加入量和OD700進(jìn)行線性回歸，得到:水提取液R2=0.9981，乙醇取液R2=0.9947，甲醇提取液R2=0.9994。

3 結(jié)論

采用不同溶劑從蒸汽爆破甘蔗渣中提取酚類物質(zhì)是可行的。結(jié)果表明，乙醇、甲醇和乙酸乙酯對于Folin－Ciocalteu法測定酚類物質(zhì)沒有干擾，均具有較高的精密度和加樣回收率。經(jīng)測定，以甲醇提取液中的酚類物質(zhì)含量最大，為(1.5174±0.0140)mg/mL;水提取液中的酚類物質(zhì)含量次之，為(1.2382±0.0025) mg/mL;以乙酸乙酯提取液中的酚類物質(zhì)含量最小，為(0.1110±0.0009)mg/mL。DPPH自由基清除能力和還原力表明，水提取液與甲醇、乙醇提取液均具有較強(qiáng)的抗氧化能力且相差不大，均具有一定的量效關(guān)系。水提取液中的糖含量較大，此部分可能為半纖維素降解得到的木糖、低聚木糖和木聚糖，進(jìn)一步的研究將對其成分進(jìn)行分析、分離純化。綜上可得出如下結(jié)論:采用乙醇、甲醇和水對蒸汽爆破甘蔗渣中的酚類物質(zhì)進(jìn)行提取是可行的。而且乙醇和水對蒸汽爆破甘蔗渣具有脫毒作用［18－19］?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境問題及水提取液中酚類含量、總糖含量以及抗氧化能力，認(rèn)為以水作為蒸汽爆破甘蔗渣中酚類物質(zhì)提取的溶劑最為合理。

圖2 不同溶劑提取液的還原力Fig.2 Reducing power of different solvent extracts

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Extraction and evaluation of antioxidants from steam exploded sugarcane bagasse

LI Jing－bo，LIN Jiang－h(huán)ai，XIAO Wen－juan，LIU Ze－h(huán)uan*
(Research Center for Molecular Biology，Institutes of Life and Health Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Solvents(ethanol，methanol，water and ethyl acetate)were used to extract the phenols and sugars from the steam exploded sugarcane bagasse(SESB)and the evaluation of their antioxidant activity was conducted.The result showed that phenolic content in methanol－extract was the highest，about(1.5174±0.0140)mg/mL and followed by aqueous－extract，(1.2382±0.0025)mg/mL，while the lowest in ethyl acetate，about(0.1110±0.0009) mg/mL.The sugar content in aqueous extract was the highest and followed by methanol extract and also was lowest in ethyl acetate.Moreover，strong DPPH radical scavenging ability was found in the four extracts.Reducing power of three of them were not only very strong but also presented a dose－dependent manner in a certain scale of concentration.The conclusion could be drawn that extraction of antioxidative compounds from SESB using water was a feasible way to obtain antioxidants when considered economic and environmental factor.

steam exploded sugarcane bagasse;phenol;total sugar;extraction;antioxidant activity

TS255.1

A

1002－0306(2012)10－0105－04

甘蔗渣是甘蔗制糖工業(yè)的下腳料，主要成分為木質(zhì)纖維素，可以經(jīng)過預(yù)處理、酶水解以及發(fā)酵制備燃料乙醇。然而，木質(zhì)纖維素具有天然的抗生物降解能力，因此，在木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化之前，預(yù)處理對于纖維素乙醇的生物轉(zhuǎn)化十分必要。蒸汽爆破預(yù)處理是當(dāng)前被廣泛應(yīng)用的化學(xué)預(yù)處理技術(shù)之一，是一種基于酸水解的預(yù)處理方法，能夠較大地提高酶水解效率［1］。蒸汽爆破預(yù)處理不僅會改變底物甘蔗渣的結(jié)構(gòu)，還會使底物中的半纖維素和木質(zhì)素發(fā)生水解反應(yīng)。半纖維素酸水解產(chǎn)物中含有微生物生長抑制因子，阻礙了下游發(fā)酵［2］，而且木質(zhì)素水解產(chǎn)物如酚類物質(zhì)也會抑制微生物的生長。但是這些在發(fā)酵培養(yǎng)基中具有抑制微生物生長的因子卻可以在食品工業(yè)中被用來作為防止食品酸敗和延長存儲期的有用物質(zhì)［3］。因此，提取蒸汽爆破甘蔗渣中的酚類物質(zhì)以及其他毒性因子不但有利于乙醇發(fā)酵菌種的生長，而且可以得到食品工業(yè)中有用的添加劑。隨著對自然來源的食品添加劑需求的不斷增加，人們已經(jīng)特別注意到以植物廢棄物為原料制備食品添加劑［4］。已有大量研究表明酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性［3，5］，可以用作食品添加劑。本研究評估了Folin－Ciocalteu法在測定蒸汽爆破甘蔗渣不同溶劑提取液中酚類物質(zhì)含量的方法適用性以及不同溶劑提取液的DPPH自由基清除能力、還原力。檢測了不同溶劑提取液中總糖的含量，為下游發(fā)酵工藝路線設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2011－11－07 *通訊聯(lián)系人

李晶博(1985－)，男，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師。研究方向:纖維素綜合利用。

廣州市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2009Z2－D521);中華環(huán)?；饡G動未來項(xiàng)目。