衣美艷，范秀萍，吳紅棉，胡雪瓊

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025）

改性殼聚糖脫除馬氏珠母貝糖胺聚糖中鎘的初步研究

衣美艷，范秀萍*，吳紅棉，胡雪瓊

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025）

采用L-半胱氨酸改性殼聚糖對馬氏珠母貝糖胺聚糖中的重金屬鎘離子進行脫除研究，通過單因素實驗和正交實驗探討了pH、反應(yīng)時間和改性殼聚糖的添加量對糖胺聚糖中鎘離子的脫除率和糖胺聚糖（GAG）含量的影響，并且利用SPSS對正交實驗的數(shù)據(jù)進行處理分析，結(jié)果表明：在馬氏珠母貝酶解液中添加L-半胱氨酸改性殼聚糖吸附鎘離子的最佳pH為6.0，時間為5h，添加量為0.6g/50mL，然后將酶解液經(jīng)離心、醇沉得到的糖胺聚糖中鎘離子的脫除率達到56.7%，GAG含量為42.8%。

L-半胱氨酸改性殼聚糖，SPSS，糖胺聚糖，鎘脫除率

1 材料與方法

1.1 實驗材料

馬氏珠母貝全臟器 購自湛江東風(fēng)市場，經(jīng)去殼放冰箱冷凍備用；殼聚糖、L-半胱氨酸（BR）、阿利新藍 均購自上海藍季科技發(fā)展有限公司；其余試劑 均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 L-半胱氨酸改性殼聚糖的制備[15]殼聚糖與戊二醛反應(yīng)，制得Schiff堿殼聚糖[16]，再與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)制得含Schiff堿的環(huán)氧醚類殼聚糖中間體[17]；然后與L-半胱氨酸反應(yīng)得到L-半胱氨酸Schiff堿殼聚糖；最后脫去戊二醛，制得帶有羧基的多官能團不溶性的L-半胱氨酸改性殼聚糖[18]。

1.2.2 馬氏珠母貝糖胺聚糖的制備[19]原料→解凍、勻漿→酶解（雙酶水解）→滅酶→單層紗布粗濾→（濾液）脫色→雙層紗布精濾→離心→上清液醇沉→離心、去上清液→洗滌→干燥→GAG粗品

1.2.3 糖胺聚糖粗品中鎘的檢測 參照GB/T 5009.15—1996《食品中鎘的測定方法》[20]，樣品經(jīng)濕法消化后，用火焰法原子吸收光譜法測定鎘的含量。

1.2.4 糖胺聚糖粗品中GAG含量的測定 采用阿利新藍比色法測定馬氏珠母貝糖胺聚糖粗品中GAG的含量[2]。

1.2.5 鎘脫除率與GAG含量的計算 計算公式如下：

式中：M1：脫鎘前GAG粗品中鎘含量（mg/kg）；M2：脫鎘后GAG粗品中鎘含量（mg/kg）。

1.2.6 單因素實驗

1.2.6.1 酶解液pH實驗 量取50mL珠母貝酶解液，置于100mL錐形瓶中，分別調(diào)節(jié)酶解液的pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入改性殼聚糖0.5g，常溫下攪拌5h，離心，上清液醇沉制得糖胺聚糖粗品，測定其中鎘含量。3次重復(fù)。

1.2.6.2 脫除時間實驗 量取50mL珠母貝酶解液，置于100mL錐形瓶中，調(diào)pH7.0，加入改性殼聚糖0.5g，常溫下分別攪拌3、4、5、6、7h，離心，上清液醇沉制得糖胺聚糖粗品，測定其中鎘含量。3次重復(fù)。

1.2.6.3 改性殼聚糖添加量實驗 量取50mL珠母貝酶解液，置于100mL錐形瓶中，調(diào)pH7.0，分別加入L-半胱氨酸改性殼聚糖0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/50mL，常溫下攪拌5h，離心，上清液醇沉制得糖胺聚糖粗品，測定其中鎘含量。3次重復(fù)。

1.2.7 正交實驗 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇pH（A）、反應(yīng)時間（B）和改性殼聚糖添加量（C）三因素，外加一空白項（D），進行有空白列的L9（34）的正交實驗[21]（見表1），并用SPSS對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析[22-24]，考察改性殼聚糖對GAG粗品中鎘的最佳脫除條件。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）experiment for synthesis of sodium cyclamate

2 結(jié)果與分析

2.1 GAG粗品中鎘脫除條件的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)pH對GAG粗品中鎘脫除率和GAG含量的影響 由圖1可看出，L-半胱氨酸改性殼聚糖對糖胺聚糖的脫鎘率在pH=5.0時最高，隨著pH的增大，脫鎘率呈顯著降低趨勢。這是因為，在酸性條件下改性殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的羧基呈酸性，結(jié)構(gòu)中活性基團活性增強[15]，所以在酸性條件下脫鎘率最大；而在堿性條件下，Cd2+會與-OH-形成Cd（OH）2沉淀而不利于吸附，故脫鎘率降低。在pH為5.0和9.0之間GAG含量先增大后減小，在pH=7.0時達到最大值。說明過酸和過堿的條件都會明顯影響GAG的含量。因此，綜合考慮L-半胱氨酸改性殼聚糖最佳的吸附條件是pH6.0~8.0之間。

圖1 pH對脫鎘率和GAG含量的影響Fig.1 Influence of pH on cadmium removal rate and GAG yield

2.1.2 反應(yīng)時間對GAG粗品中鎘脫除率和GAG含量的影響 由圖2可看出，隨著反應(yīng)時間的增加，脫鎘率也在不斷增加，從3h到5h階段，脫鎘率增加迅速，在5h時脫鎘率達到最大，之后基本趨于穩(wěn)定。原因可能是在5h時L-半胱氨酸改性殼聚糖對鎘離子的吸附達到飽和，再延長時間也不會增大脫鎘效果。而GAG含量在6h之前隨時間的增加幾乎無變化，但6h之后GAG含量開始降低，可能是因為L-半胱氨酸改性殼聚糖對鎘離子的吸附達到飽和之后，會吸附部分的糖胺聚糖導(dǎo)致GAG含量下降。

圖2 反應(yīng)時間對脫鎘率和GAG含量影響Fig.2 Influence of adsorption time on cadmium removal rate and GAG yield

2.1.3 改性殼聚糖添加量對GAG粗品中鎘脫除率和GAG含量的影響 由圖3可知，隨L-半胱氨酸改性殼聚糖添加量的增大，脫鎘率明顯增大，在0.5g/50mL時達到最大值，之后則基本趨于穩(wěn)定。這是因為在0.5g/50mL時，L-半胱氨酸改性殼聚糖對鎘離子的吸附幾乎達到飽和，再增加用量時，鎘的去除率趨于穩(wěn)定，增加不明顯。而GAG含量在0.6g/50mL之前基本不變，當(dāng)再增加用量時，GAG含量開始下降，可能是由于過量的L-半胱氨酸改性殼聚糖吸附掉了部分的糖胺聚糖。

2.2 GAG粗品中鎘脫除條件的正交實驗結(jié)果

通過SPSS軟件對脫鎘率和GAG含量的正交實驗見表2，分析結(jié)果如表3、表4所示。

圖3 L-半胱氨酸改性殼聚糖添加量對脫鎘率和GAG含量的影響Fig.3 Influence of L-cysteine modified chitosan dosage on Cadmium removal rate and GAG yield

表2 正交實驗結(jié)果表Table 2 Experimental results of the orthogonal design

表3 方差分析（脫鎘率）Table 3 Variance analysis（cadmium removal rate）

表4 方差分析（GAG含量）Table 4 Variance analysis（GAG yield）

極差R越大，表明該因素對脫鎘率和GAG含量的影響越大。由表2分析結(jié)果可以看出，各因素對脫鎘率影響的大小順序依次為：反應(yīng)pH>反應(yīng)時間>添加量。根據(jù)值比較分析，最優(yōu)組合為A1B1C3，即吸附的最佳條件為：pH為6.0，反應(yīng)時間為4h，添加量為0.6g/50mL。各因素對GAG含量影響的大小順序依次為：反應(yīng)pH>添加量>反應(yīng)時間。根據(jù)值比較分析，最優(yōu)組合為A1C3B2，即吸附的最佳條件為：pH為6.0，添加量為0.6g/50mL，反應(yīng)時間為5h。

因為本實驗研究的是糖胺聚糖中鎘的脫除率，所以在保證具有良好的鎘脫除效果的同時，糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)與含量是需要考慮的重要因素，根據(jù)SPSS軟件對正交實驗數(shù)據(jù)的分析結(jié)果（表3、表4）可看出，B對脫鎘率的顯著值（sig.）為0.041（p<0.05），對GAG含量的顯著值（sig.）為0.004（p<0.01），說明反應(yīng)時間對GAG含量的影響較脫鎘率更顯著[25]。所以對以上分析結(jié)果進行綜合考慮，得出L-半胱氨酸改性殼聚糖吸附脫除糖胺聚糖中鎘離子的最優(yōu)條件組合為：A1B2C3，即pH為6.0，反應(yīng)時間為5h，添加量為0.6g/50mL。根據(jù)得到的最佳脫除條件，進行驗證性實驗，實際得到的脫鎘率為56.7%，GAG含量為42.8%，驗證實驗結(jié)果與正交實驗結(jié)果相符，說明L-半胱氨酸改性殼聚糖在該條件下穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

本實驗利用L-半胱氨酸改性殼聚糖進行馬氏珠母貝糖胺聚糖中鎘脫除研究，通過正交實驗優(yōu)化法和SPSS軟件數(shù)據(jù)分析法得到的最佳吸附條件為：pH為6.0、吸附時間5h、添加量為0.6g/50mL。在此條件下，糖胺聚糖中鎘的脫除率為56.7%，GAG含量為42.8%。本方法在保證活性物質(zhì)糖胺聚糖含量的前提下，有效降低了其中重金屬鎘的含量，可為貝類尤其是馬氏珠母貝中鎘的脫除提供有益參考。

[1]Hemorth B.Factors in fluencing bactericidal activity of bluemussel （Mytilus edulis） haemocytes against Salmonellatyphimurium[J].Fish Shellifsh Immuno，2003，14（2）：93-104.

[2]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：79，397-400.

[3]XU B，PER H，HENRIK S，et al.Endo-beta-1，4-Mannanases from bluemussel，mytilus edulis.Purification，characterization andmode of action[J].J Biotechno，2001（2）：267-277.

[4]張豁中，溫玉麟.動物活性成分化學(xué)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1995：996-998.

[5]王長云，管華詩，李八方.氨基多糖研究概況與展望[J].生物工程進展，1995，15（6）：2-9.

[6]沈鳴，陳建偉.氨基多糖的藥理研究進展[J].上海醫(yī)藥，2001，22（6）：268-270.

[7]廖艷，吳曉萍.湛江常見食用貝類體內(nèi)痕量Pb、Cd的含量分析[J].微量元素與健康研究，2007，24（5）：31-32.

[8]食品中鉛限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).GB14935-94[S].

[9]梁鵬，吳曉萍，徐慧，等.殼聚糖脫除牡蠣勻漿液中重金屬鎘的初步研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（7）：107-109.

[10]CriniG.Recent developments in polysaccharide-basedmaterials used as adsorbents in wastewater treatment[J].Prog Polym Sci，2005，30（1）：38-70.

[11]Rinaudo M.Chitin and chitosan：Properties and applications[J].Progress Polym Sci，2006，31（7）：603-632.

[12]程紅霞，林強.殼聚糖對中藥水提液中重金屬殘留的吸附特性研究[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，20（1）：69-72.

[13]孫繼鵬，汪東風(fēng)，李國云，等.殼寡糖鈣、鎂配合物對櫛孔扇貝體內(nèi)鎘的脫除[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報，2010，40（2）：33-37.

[14]劉炳杰，汪東風(fēng)，孫繼鵬，等.交聯(lián)殼聚糖樹脂對扇貝裙邊酶解液中鎘的脫除研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，37（1）：11-14.

[15]吳曉萍，梁鵬，章超樺，等.L-半胱氨酸改性殼聚糖的合成與表征[J].功能材料，2010，S1：172-174.

[16]Kim J H，Lee Y M.Polymer[J].Membr Sci，1993，34（9）：1952.

[17]莊莉，楊智寬.含硫殼聚糖研究——氨基硫脲接枝殼聚糖的合成[J].化學(xué)試劑，2002，24（5）：283.

[18]楊智寬，袁揚，汪玉庭.氮雜冠醚殼聚糖研究（Ⅲ）──雙羥基中環(huán)二胺交聯(lián)殼聚糖的制備[J].化學(xué)試劑，2002，22（2）：69.

[19]吳紅棉，雷曉凌，洪鵬志，等.珠母貝糖胺聚糖的純化及其化學(xué)性質(zhì)[J].水產(chǎn)學(xué)報，2000，24（6）：570-574.

[20]食品中鎘的測定方法.GB/T 5009.15—1996[S].

[21]何秋月.SPSS在L9（34）正交實驗數(shù)據(jù)處理中的應(yīng)用[J].應(yīng)用技術(shù)，2005，12（3）：27-29.

[22]鄧振偉，于萍，陳玲.SPSS軟件在正交實驗設(shè)計、結(jié)果分析中的應(yīng)用[J].電腦學(xué)習(xí)，2009（5）：15-17.

[23]張福生，郭順星.SPSS正交設(shè)計在福建金線蓮組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，2009，34（20）：2581-2585.

[24]張凌云，孫其富，孫慶磊，等.SPSS軟件在綠茶鮮汁浸提工藝研究中的應(yīng)用[J].糧油加工與食品機械，2003（3）：58-60.

[25]孫影.SPSS13.0軟件在化學(xué)正交設(shè)計實驗中的應(yīng)用[J].化學(xué)教育，2006（8）：48-49.

Study on removing cadmium in glycosaminoglycan from Pinctada martensii by adding modified chitosan

YI Mei-yan，F(xiàn)AN Xiu-ping*，WU Hong-mian，HU Xue-qiong
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China）

The cadmium ion in glycosaminoglycan（GAG）from Pinctada martensii was removed by L-cysteine modified chitosan.The effects of pH，adsorption time and L-cysteine modified chitosan dosage on cadmium removal rate and GAG yield were discussed through single factor and orthogonal experiment.And the data in orthogonal experiment were processed and analyzed by using SPSS.The experiment results indicated that removal conditions were pH=6.0，the adsorption time 5h and L-cysteine modified chitosan dosage 0.6g/50mL. Under the optimized conditions，cadmium removal rate reached 56.7%，GAG yield reached 42.8%.

L-cysteine modified chitosan；SPSS；glycosaminoglycan；cadmium removal rate

TS201.2+3

A

1002-0306（2012）07-0105-04

糖胺聚糖（GAG）是貝類生物中含量豐富的生物活性物質(zhì)[1-3]，是作為新型創(chuàng)新藥物和功能性保健食品的重要資源，日益受到人們的重視[4-5]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其在抗癌、提高免疫、降血脂、抗氧化、抗血栓等方面有較強的活性[6]。然而由于環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，加上貝類對重金屬具有較強的蓄積能力，使得一些貝類重金屬含量過高。廖艷等對湛江常見的11種食用貝類進行研究[7]，參照國家限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[8]，發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝鎘含量高達3.26mg/kg。重金屬作為一種持久性污染物已越來越多地受到關(guān)注和重視，重金屬污染現(xiàn)已成為全球較普遍的食品安全問題。梁鵬等[9]利用殼聚糖對牡蠣水解液中鎘的吸附率達98.0%以上，但殼聚糖溶于酸性溶液，應(yīng)用范圍受到很大限制，也不利于回收再利用。因此，人們通過改變殼聚糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)制備出多種優(yōu)質(zhì)改性殼聚糖，應(yīng)用于水體、中藥、貝類中重金屬的吸附，取得了大量的研究和實踐成果[10-13]。其中，劉炳杰等[14]利用交聯(lián)殼聚糖CTS-Zn樹脂對扇貝裙邊酶解液中鎘的脫除率達80.0%以上，但對其他礦質(zhì)元素和營養(yǎng)成分有一定的吸附作用。目前很少有脫除貝類多糖中重金屬的相關(guān)報道，因此對于在如何盡可能地保證糖胺聚糖含量的前提下，進行有效地除去或減少多糖中重金屬的研究是非常必要的。因此，本文采用L-半胱氨酸改性殼聚糖[15]進行馬氏珠母貝糖胺聚糖中鎘的脫除研究，對L-半胱氨酸改性殼聚糖吸附酶解液中鎘離子的條件進行初步探討，為貝類多糖中重金屬鎘的脫除方法提供實驗依據(jù)。

2011－07－07 *通訊聯(lián)系人

衣美艷（1984-），女，在讀碩士研究生，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)。