李丁寧，劉良忠，劉培勇，劉 亮，王 燕

（武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

低值淡水魚(yú)蛋白酶法水解工藝研究

李丁寧，劉良忠*，劉培勇，劉 亮，王 燕

（武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

以水解度為指標(biāo)，考察酶解溫度、pH、底物濃度、加酶量等因素對(duì)鰱魚(yú)蛋白水解度的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用中心復(fù)合組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解溫度、pH和加酶量進(jìn)行優(yōu)化，以氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，確定最佳酶解時(shí)間。結(jié)果表明：酶解pH9.37，酶解溫度48.33℃，酶與底物比93.87AU/kg，酶解時(shí)間6h，在此條件下水解體系水解度為39.54%，氨基酸態(tài)氮含量為2.31g/L，總氮回收率為93.55%，蛋白質(zhì)濃度為3.62%。

白鰱魚(yú)，堿性蛋白酶，水解

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白鰱魚(yú) 購(gòu)于武漢工業(yè)學(xué)院常青花園菜市場(chǎng)（粗蛋白18.10%，水分72.3%）；木瓜蛋白酶（Papain）、堿性蛋白酶（Alcalase）、中性蛋白酶（Neutrase）、風(fēng)味蛋白酶 南寧龐博生物技術(shù)責(zé)任有限公司；氫氧化鈉、甲醛 分析純。

DF-1數(shù)顯集熱式磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；PHS-25 pH計(jì)、722S型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-80-2B型離心機(jī) 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水解液的制備工藝 原料預(yù)處理→原料解凍→加水混勻→調(diào)節(jié)溫度→調(diào)節(jié)pH→加酶→控制適宜的溫度和pH進(jìn)行水解→滅酶（95℃，15min）→冷卻→離心（3500r/min，15min）→取上清液→濃縮→冷凍干燥→低值淡水魚(yú)呈味蛋白粉。

原料預(yù)處理：將去鱗、去內(nèi)臟的白鰱魚(yú)用清水清洗干凈，放入魚(yú)肉5倍重量的脫腥液中脫腥10min，用清水沖洗3遍，瀝干后加入一定比例的水，用攪拌器絞成糜狀（為保證原料的均勻一致及絞碎程度，進(jìn)行了兩次絞碎處理），分裝后置于-18℃的冰柜凍藏備用。

1.2.2 水解條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)方法 考察酶解溫度、pH、底物濃度、加酶量等因素對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)蛋白水解的影響。

1.2.2.2 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以影響白鰱魚(yú)蛋白水解度的pH（X1）、溫度（X2）及酶與底物比（X3，[E]/[S]）為3個(gè)實(shí)驗(yàn)因子，以白鰱魚(yú)蛋白的水解度（Y）為指標(biāo)，做三因素中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)，共計(jì)23個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，確定白鰱魚(yú)蛋白水解的最優(yōu)工藝條件。

表1 白鰱魚(yú)蛋白水解三因素二次中心復(fù)合設(shè)計(jì)Table 1 Code of central composite design with 3 factors on enzymatic hydrolysis of silver carp protein

1.2.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)方法研究水解時(shí)間對(duì)水解的影響 根據(jù)水解液中氨基酸態(tài)氮含量、水解度等指標(biāo)綜合研究適宜水解時(shí)間。

1.2.3 測(cè)定方法 總蛋白質(zhì)含量：凱氏定氮法；氨基態(tài)氮含量：甲醛滴定法[12]；水解度（DH）的測(cè)定[13]：pH-stat法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶的篩選 選用四種酶分別為：木瓜蛋白酶（最適pH6、最適溫度55℃、[E]/[S]2%）、堿性蛋白酶（最適pH9、最適溫度50℃、[E]/[S]2%）、中性蛋白酶（最適pH7、最適溫度50℃、[E]/[S]2%）、風(fēng)味蛋白酶（最適pH7、最適溫度50℃、[E]/[S]2%），按照蛋白酶說(shuō)明書(shū)中推薦的最適條件對(duì)白鰱魚(yú)進(jìn)行水解，自反應(yīng)開(kāi)始每間隔1h測(cè)水解度。不同酶制劑對(duì)白鰱魚(yú)蛋白水解度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 酶的種類(lèi)對(duì)蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of the enzyme sorts on the DH of silver carp protein

由圖1可知，四種蛋白酶的水解效果由好到差依次為：堿性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。其原因可能是由于四種蛋白酶具有不同的純度、活性或底物專(zhuān)一性，因此選用堿性蛋白酶水解較為合適。

2.1.2 底物濃度對(duì)堿性蛋白酶水解魚(yú)蛋白的影響 在pH為9.0、酶與底物比為24AU/kg、水解溫度為50℃，以魚(yú)肉濃度為15%、20%、25%和30%的條件下進(jìn)行酶解，不斷滴加1mol/L氫氧化鈉使pH保持在9.0，記錄不同時(shí)間（15、30、60、90、120、150、180min）堿液的消耗量，根據(jù)pH-stat法計(jì)算水解度。

圖2 堿性蛋白酶在不同底物濃度時(shí)的水解進(jìn)程曲線Fig.2 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different substance concentrations

2.1.3 pH對(duì)堿性蛋白酶水解魚(yú)蛋白的影響 以魚(yú)肉濃度為20%、酶與底物比為24AU/kg、水解溫度為50℃，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH為8、8.5、9、9.5和10。隨著酶解的進(jìn)行，不斷滴加1mol/L氫氧化鈉使pH保持在8、8.5、9、9.5和10，記錄不同時(shí)間（15、30、60、90、120、150、180min）堿液的消耗量，根據(jù)pH-stat法計(jì)算水解度。

圖3 堿性蛋白酶在不同pH時(shí)的水解進(jìn)程曲線Fig.3 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different pH values

由圖3可知，對(duì)環(huán)境pH的敏感是堿性蛋白酶的特點(diǎn)之一[14]。當(dāng)pH在8～9范圍內(nèi)，隨著pH的增加水解度增加，當(dāng)pH大于9.5時(shí)，隨著pH的增加水解度降低。因此，堿性蛋白酶水解鰱魚(yú)蛋白時(shí)應(yīng)控制pH在9左右。

2.1.4 水解溫度對(duì)堿性蛋白酶水解魚(yú)蛋白的影響 在魚(yú)肉濃度為20%、酶與底物比為24AU/kg、pH為9，水解溫度分別為40、45、50、55℃的條件下進(jìn)行酶解，隨著酶解的進(jìn)行，pH保持在9，記錄不同時(shí)間（15、30、 60、90、120、150、180min）堿液的消耗量，根據(jù)pH-stat法計(jì)算水解度。

圖4 堿性蛋白酶在不同溫度時(shí)的水解進(jìn)程曲線Fig.4 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different temperatures

由圖4可知，酶在一定條件下都有其一定的最適溫度[14]。當(dāng)溫度在40～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加水解度增加，當(dāng)溫度大于50℃時(shí)，隨著溫度的增加水解度降低。因此，堿性蛋白酶水解鰱魚(yú)蛋白時(shí)應(yīng)控制溫度在50℃左右。

2.1.5 不同酶與底物比對(duì)堿性蛋白酶水解魚(yú)蛋白的影響 在魚(yú)肉濃度為20%、pH為9、水解溫度為50℃的條件下改變酶的添加量，酶與底物比分別為96、72、48、24、12AU/kg。隨著酶解的進(jìn)行，pH保持在9，記錄不同時(shí)間堿液的消耗量（15、30、60、90、120、150、180min），根據(jù)pH-stat法計(jì)算水解度。

圖5 堿性蛋白酶在不同酶與底物比時(shí)的水解進(jìn)程曲線Fig.5 Hydrolysis curves for fish protein with alcalase at different[E]/[S]

酶與底物比能在一定值上下自由變動(dòng)。在此值以下，有些酶將出現(xiàn)特異性變窄現(xiàn)象，即在很低的酶與底物比時(shí)，即使反應(yīng)在適當(dāng)?shù)乃舛冉K止，但酶的水解作用并不完全；在此值以上，酶與底物比越高反應(yīng)速度越快，但酶用量增大引起成本增加，因此應(yīng)控制酶與底物比在可以接受的時(shí)間內(nèi)完成反應(yīng)[15]。

由圖5可知，隨著酶的濃度的增加，堿性蛋白酶水解魚(yú)蛋白的速度升高，但水解度的升高并不與加酶量同倍數(shù)增加。考慮到堿性蛋白酶價(jià)格較貴，因此選用的酶與底物比為72AU/kg。

2.2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其模型分析與檢驗(yàn)

伊犁河谷向來(lái)有塞外江南的美譽(yù)，“察布查爾”在錫伯語(yǔ)里譯為糧倉(cāng)，當(dāng)?shù)爻霎a(chǎn)的有機(jī)大米在全國(guó)享譽(yù)美名，農(nóng)業(yè)發(fā)展在這個(gè)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占據(jù)著十分重要的地位。伊犁河南岸的孫扎齊鄉(xiāng)也不例外。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以影響白鰱魚(yú)蛋白水解度的pH（X1）、溫度（X2）及酶與底物比（X3）為3個(gè)實(shí)驗(yàn)因子，以白鰱魚(yú)蛋白的水解度（Y）為指標(biāo)，做三因素中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)，共計(jì)23個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，白鰱魚(yú)蛋白的水解度見(jiàn)表2。用Minitab軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，建立水解度Y與調(diào)控因子X(jué)i間的回歸方程式為：

表2 三因素中心復(fù)合設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of central composite design tests with 3 factors

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。F回歸= 166.14＞F0.005（9，22）=4.97，P＜0.005表明模型極顯著，失擬項(xiàng)為0.331＞0.05，表明所建立的回歸方程擬合性很好。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表4可知，回歸方程及回歸系數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，主因素對(duì)水解度影響大小順序?yàn)椋篨1（pH）＞X3（酶與底物的比）＞X2（酶解溫度）。

表4 各因素的方差分析Table 4 Variance analysis of factors

2.2.1 響應(yīng)面分析 根據(jù)擬合函數(shù)，用Minitab對(duì)每?jī)蓚€(gè)因素對(duì)水解度繪制出響應(yīng)面圖，此時(shí)考慮到定性分析各因素對(duì)水解度的關(guān)系，固定另外兩個(gè)因素時(shí)，均做“0”水平處。圖6顯示為pH（X1）和酶解溫度（X2）與白鰱魚(yú)蛋白水解度的關(guān)系；圖7顯示為pH（X1）和酶與底物比（X3）與白鰱魚(yú)蛋白水解度的關(guān)系；圖8顯示為酶解溫度（X2）和酶與底物比（X3）與白鰱魚(yú)蛋白水解度的關(guān)系。

2.2.2 數(shù)學(xué)模型分析 從響應(yīng)面圖分析可知，酶解溫度、pH、酶與底物比對(duì)白鰱魚(yú)蛋白水解度具有一定的影響，同時(shí)它們之間在蛋白水解過(guò)程相互作用，采用對(duì)擬合數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量分析。

圖6 酶解溫度（X1）與pH（X2）的交互作用Fig.6 The interaction between temperature（X1）and pH（X2）

圖7 pH（X2）和酶與底物比（X3）的交互作用Fig.7 The interaction between pH（X2）and[E]/[S（]X3）

圖8 酶解溫度（X1）和酶與底物比（X3）的交互作用Fig.8 The interaction of temperature（X1）and[E]/[S]（X3）

主因素效應(yīng)分析：為了分析各主因素對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白水解度的單獨(dú)影響，由模型（1）可通過(guò)“降維法”把其他2個(gè)因素固定在零水平得3個(gè)偏子回歸模型：

對(duì)其分別求導(dǎo)，可得

令dyi/dxi=0（i=1，2，3）可求出yi極大值時(shí)各種因素單獨(dú)最適量：X1=0.5941，X2=0.0431，X3=1.8380。由主效應(yīng)模型得出各因素不同水平下水解度（見(jiàn)表5）可得：a.隨pH的提升蛋白水解度升高，1水平時(shí)增幅最高，隨后增幅度變小；b.隨酶解溫度的提升蛋白水解度增高，到0水平時(shí)最高，隨后水解度降低；c.隨酶與底物比的升高蛋白水解度增高，到2水平時(shí)達(dá)到最高。

因素間交互效應(yīng)分析。固定該模型任何3因素為0水平時(shí)可得另2因素交互效應(yīng)模型：

表5 各因素效應(yīng)分析（%）Table 5 Effective analysis of single facto（r%）

由表6知，pH（X1）、溫度（X2）的交互效應(yīng)為水解度隨pH和溫度都是先增大后減??；通過(guò)分析可得，當(dāng)在pH（X1）、溫度（X2）為（1，0）水平時(shí)為兩因素最佳水解度組合。同理可分析其他條件下的水解度。

表6 酶解溫度℃（X1）與pH（X2）交互效應(yīng)下的水解度（%）Table 6 The interplay of hydrolysis temperature（X1）and the pH（X2）

2.2.3 水解度模型優(yōu)化 根據(jù)建立的數(shù)學(xué)模型通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)，可得到116種水解度理論值分布在0%～35%之間組合方案。其中水解度在0%～20%組合方案沒(méi)有；20%～25%組合方案有38套；25%～30%組合方案有39套；30%～35%組合方案有39套。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬尋優(yōu)，在水解度最高的30%～35%組合方案39套中，可得最高水解度為30.13%，對(duì)應(yīng)組合方案為（0.733，-0.333，0.911），真實(shí)值是pH9.37，酶解溫度48.33℃，酶與底物的比93.87AU/kg。

2.3 水解時(shí)間的確定

經(jīng)過(guò)中心組實(shí)驗(yàn)，得到堿性蛋白酶水解鰱魚(yú)蛋白最佳工藝參數(shù)：pH9.37、酶解溫度48.33℃、酶與底物的比93.87AU/kg、蛋白質(zhì)濃度3.62%，在此條件下進(jìn)行酶解，每隔1h測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量、水解度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7。

表7 酶解時(shí)間對(duì)蛋白水解度的影響Table 7 The effect of hydrolysis time on the DH of fish scale collagen

由表7可知，在前6h內(nèi)，水解體系中的氨基酸態(tài)氮含量、水解度不斷增加，當(dāng)水解時(shí)間為6h時(shí)，體系的氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到了2.31g/L。此后，水解度上升緩慢，氨基酸態(tài)氮的含量不再上升。因此，綜合經(jīng)濟(jì)利益，水解白鰱魚(yú)蛋白時(shí)間應(yīng)控制在6h左右。

3 結(jié)論

用低值淡水魚(yú)制備蛋白水解液的最佳工藝參數(shù)為：酶解pH9.37，酶解溫度48.33℃，酶與底物的比93.87AU/kg、酶解時(shí)間6h，在此條件下水解體系水解度為39.54%，氨基酸態(tài)氮含量為2.31g/L，總氮回收率為93.55%，蛋白質(zhì)濃度為3.62%。酶解制得的水解液，經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥后制得魚(yú)粉，便于魚(yú)調(diào)味品的研發(fā)。

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Study on the process of hydrolyzing protein by enzyme in low value freshwater fish

LI Ding-ning，LIU Liang-zhong*，LIU Pei-yong，LIU Liang，WANG Yan
（College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

As an index to the degree of hydrolysis，the influence of factors such as enzymatic hydrolysis temperature，pH value，substrate concentration，and enzyme dosage to the degree of silver carp protein hydrolysis was investigated.The reaction temperature，pH，and enzyme dosage was optimized by a combination of central composite design experiment based on the single-factor experiment and the best enzymatic hydrolysis time was made as an index to amino nitrogen.The best hydrolysis condition was pH 9.37，enzymatic hydrolysis temperature 48.33℃，[E]/[S]93.87AU/kg，reaction time 6h，under the condition，the protein concentration was 3.62%，the degree of hydrolysis 39.54%，amino acid nitrogen content 2.31g/L，and total nitrogen recovery rate was 93.55%.

silver carp；alcalase；hydrolysis

TS254.1

B

1002-0306（2012）03-0232-05

近年來(lái)，我國(guó)的漁業(yè)生產(chǎn)發(fā)展很快，尤其是淡水魚(yú)生產(chǎn)加工的發(fā)展更為迅速。生產(chǎn)成本低廉、高產(chǎn)的低值淡水魚(yú)已占到淡水魚(yú)生產(chǎn)總量的50%以上。但是除鮮銷(xiāo)極少量冷凍冷藏制品外，淡水魚(yú)深加工產(chǎn)品僅占其總產(chǎn)量的3%左右。因此，通過(guò)發(fā)展淡水魚(yú)精深加工，實(shí)現(xiàn)其二次、三次加工增值，使淡水魚(yú)加工向系列化、多樣化和高附加值方向發(fā)展，成為淡水魚(yú)加工利用的一個(gè)重要研究方向[1-2]。利用酶解的方法水解魚(yú)蛋白，將低值淡水魚(yú)進(jìn)行精深加工已成為淡水魚(yú)加工利用的一個(gè)重要研究方向[3-4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)魚(yú)蛋白酶解方面及低值魚(yú)類(lèi)綜合利用做了不少的研究[5-8]。但是利用白鰱魚(yú)蛋白水解液開(kāi)發(fā)魚(yú)調(diào)味品的研發(fā)尚處于初級(jí)階段[9-11]。實(shí)驗(yàn)以去鱗、去內(nèi)臟、脫腥后的鰱魚(yú)為原料，采用堿性蛋白酶水解，確定了酶解的最佳工藝條件，從而為后續(xù)魚(yú)調(diào)味品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

2011-05-09 *通訊聯(lián)系人

李丁寧（1982-），男，碩士研究生，主要從事食品新資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

湖北省教育廳高校產(chǎn)學(xué)研合作資助項(xiàng)目（C2010040）。