朱顯峰，余晨晨，范書軍，秦仁炳，張晶晶

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封475004）

蜜環(huán)菌水溶性多糖的抗氧化活性研究

朱顯峰，余晨晨，范書軍，秦仁炳，張晶晶

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封475004）

目的：通過蜜環(huán)菌水溶性多糖對·OH、O2－·和DPPH·三種自由基清除作用，評價其抗氧化性能，為蜜環(huán)菌藥物制劑的活性研究及其產(chǎn)品的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)提供重要參考。方法：經(jīng)熱水浸提、除蛋白等步驟分離純化到水溶性多糖，以抗壞血酸和TBHQ為對照，采用分光光度法評定其抗氧化特性。結(jié)果：蜜環(huán)菌水溶性多糖對三種自由基均有不同程度的清除活性，對三種自由基的清除能力是DPPH·>·OH>O2－·，當(dāng)清除率達(dá)到90%以上時，清除DPPH·、·OH和O2－·的所需的多糖濃度分別為1.0、5.0、6.0mg·mL-1，蜜環(huán)菌多糖的清除能力顯著。結(jié)論：蜜環(huán)菌水溶性多糖在體外具有較明顯的抗氧化活性，在實驗濃度范圍內(nèi)，抗氧化效果與濃度呈顯著的線性相關(guān)。作為一種重要的天然活性物質(zhì)，蜜環(huán)菌多糖的抗氧化活性和抗衰老作用將具有較高的應(yīng)用價值。

蜜環(huán)菌，水溶性多糖，抗氧化，自由基

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）是一種與天麻共生的藥食兩用真菌，其產(chǎn)品制劑是治療頭痛、眩暈、神經(jīng)衰弱的有效藥物，蜜環(huán)菌深層發(fā)酵產(chǎn)物中富含嘌呤類化合物、必需氨基酸、蜜環(huán)菌多糖和倍半萜類化合物等多種有效成分，這些天然活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的神經(jīng)調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痙熄風(fēng)、增智健腦和延緩衰老等藥理作用，并可提高機(jī)體免疫功能。蜜環(huán)菌多糖作為主要的活性成分，對其抗氧化作用的分析，為有效評價蜜環(huán)菌多糖的抗衰老功能提供重要參考[1-2]。為此，我們提取了蜜環(huán)菌菌粉的水溶性多糖，通過與抗壞血酸、TBHQ的對比，對其清除羥基自由基、超氧陰離子和DPPH自由基能力進(jìn)行了系統(tǒng)研究。對提高蜜環(huán)菌藥品療效、開展蜜環(huán)菌產(chǎn)品制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和促進(jìn)蜜環(huán)菌多糖類產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鄰苯三酚、三羥甲基胺基甲烷（Tris） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸亞鐵、雙氧水（H2O2） 天津市德思化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） Sigma公司；抗壞血酸 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；特丁基對苯二酚（TBHQ） Alfa Aesar公司，以上均為分析純試劑；蜜環(huán)菌菌粉 由河南龍都藥業(yè)有限公司提供。

TU-1201紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜜環(huán)菌水溶性多糖的提取與純化 稱取5g蜜環(huán)菌菌粉用50mL蒸餾水80℃水浴3h后，離心，剩余物再加入50mL蒸餾水，繼續(xù)水浴2h，合并濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積1/5。加入三倍體積的95%乙醇沉淀24h，4000r/min離心得粗多糖。粗多糖依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗3次，干燥。沉淀用蒸餾水80℃水浴下充分溶解，離心得上清液。上清液用Sevage法除蛋白，按其體積的1/5加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），4000r/min離心15min，除去中間變性蛋白和溶劑層，重復(fù)操作4次以上，直至除盡蛋白質(zhì)。將除完蛋白質(zhì)的上清液減壓濃縮至1/3，加入3倍體積95%乙醇沉淀24h，沉淀再次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗3次，40℃下真空干燥8h得供試樣品[3]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與粗多糖含量的測定 精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖25mg，置250mL容量瓶中，定容。分別精密吸取以上標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至干燥的具塞試管中，補(bǔ)水至2mL。加入5%苯酚溶液1mL和5mL濃硫酸迅速反應(yīng)，冷卻至室溫。以相應(yīng)空白試劑為對照，在490nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以校正系數(shù)0.9校正多糖mg數(shù)。

稱量從5g菌粉中所提取到的蜜環(huán)菌多糖的干重，按苯酚-硫酸法測定粗多糖水溶液的多糖含量[4]。多糖得率（mg·g-1）=總糖質(zhì)量/蜜環(huán)菌菌粉質(zhì)量。

1.2.3 蜜環(huán)菌水溶性多糖的紫外-可見吸收光譜圖 分離純化后的多糖適量溶于蒸餾水中，用紫外-可見分光光度計在200～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.2.4 清除羥基自由基（·OH）活性的測定 利用H2O2與Fe2+混合反應(yīng)產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm下有最大吸收。反應(yīng)體系中含8.8mmol·L-1的H2O21mL，9mmol·L-1的FeSO41mL，9mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液1mL和不同濃度的多糖溶液各1mL，蒸餾水為參比。其中，H2O2最后加入并啟動整個體系，37℃反應(yīng)30min。以抗壞血酸、TBHQ作為對照組，每個濃度重復(fù)三次，取其吸光度的平均值[5-6]。

式中：A0為加入FeSO4、水楊酸、H2O2，不加入多糖溶液的吸光度值；AX為加入FeSO4、水楊酸、H2O2、多糖溶液的吸光度值；AX0為加入FeSO4、水楊酸、多糖溶液，不加H2O2的吸光度值。

1.2.5 清除超氧陰離子（O2－·）能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法。取0.05mol·L-1pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5mL于試管中，放入25℃水浴中保溫10min，加入不同濃度的多糖溶液1mL，混勻后加入0.4mL 6mmol·L-1的鄰苯三酚（以10mmol·L-1的HCl配制），計時4min，加入8mol·L-1的HCl溶液1.0mL終止反應(yīng)，每個濃度重復(fù)三次。以抗壞血酸、TBHQ作為對照組，320nm下測其吸光值[7]。

式中：A0為用水代替多糖時測得的吸光值；Ai為不同多糖濃度下測得的吸光值；Aj為用水代替鄰苯三酚時不同多糖濃度下測得的吸光值。

1.2.6 清除DPPH自由基能力的測定 利用DPPH溶液的特征紫紅色吸收峰，加入抗氧化劑或多糖溶液后吸光值的下降表示其對自由基的清除能力。DPPH用甲醇配制成0.2mmol·L-1，取2mL此溶液與2mL不同濃度的多糖溶液暗室中反應(yīng)30min，每個濃度重復(fù)三次。以抗壞血酸、TBHQ作為對照組，517nm下測定其吸光值[8-9]。

式中：A0為加入2mL DPPH和2mL甲醇測得的吸光值；Ai為加入2mL DPPH和2mL多糖溶液測得的吸光值；Aj為加入2mL多糖溶液和2mL甲醇測得的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

本實驗繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y= 0.03448+7.23714X，r=0.99399。表明葡萄糖在0.02～0.1g·L-1呈良好的線性關(guān)系。

本實驗所得到的蜜環(huán)菌水溶性粗多糖，多糖得率為28.16mg·g-1（干重）。

2.2 蜜環(huán)菌水溶性多糖的紫外-可見吸收光譜圖

紫外光譜分析結(jié)果表明紫外吸收譜在200nm處有一吸收峰，無明顯核酸、蛋白類物質(zhì)及其他雜質(zhì)的特征吸收峰。結(jié)果見圖1。

圖1 蜜環(huán)菌多糖的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV visible absorption spectrum of Armillaria mellea polysaccharide

2.3 蜜環(huán)菌多糖對·OH的清除作用

測定濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg·mL-1的粗多糖水溶液、抗壞血酸、TBHQ溶液對羥基自由基的清除作用，結(jié)果見圖2。

由圖1可知，隨著溶液濃度的增大，蜜環(huán)菌多糖、抗壞血酸和TBHQ的清除效果也得到進(jìn)一步的提高，對照抗壞血酸和TBHQ的清除能力相當(dāng)，濃度為0.2mg·mL-1時兩者的清除率均達(dá)到50%左右。蜜環(huán)菌多糖在5mg·mL-1濃度下對羥基自由基的清除率達(dá)到100%，低濃度0.1mg·mL-1仍有21.98%的清除作用，清除效果明顯。

圖2 蜜環(huán)菌多糖、TBHQ和抗壞血酸對·OH的清除效果Fig.2 Removed effect of Armillaria mellea，TBHQ and ascorbic acid on·OH

2.4 蜜環(huán)菌多糖對O2－·的清除作用

測定濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg·mL-1的粗多糖水溶液、抗壞血酸和TBHQ溶液對超氧陰離子的清除作用，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明，蜜環(huán)菌多糖對O2－·的清除作用較弱，在濃度為1.0mg·mL-1時清除率只有2.49%，當(dāng)濃度增加到6mg·mL-1時，清除率可達(dá)到97.34%。隨著濃度的增大，顯示出了一定的清除活性。蜜環(huán)菌多糖對超氧陰離子的清除能力要優(yōu)于化學(xué)合成的抗氧化劑TBHQ，但與對照抗壞血酸相比，兩者之間的清除效果相差較大。

圖3 蜜環(huán)菌多糖、TBHQ和抗壞血酸對O2-·的清除效果Fig.3 Removed effect of Armillaria mellea，TBHQ and ascorbic acid on O2－·

2.5 蜜環(huán)菌多糖對DPPH自由基的清除作用

選取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的粗多糖水溶液和0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的抗壞血酸和TBHQ溶液，測定其對DPPH自由基的清除作用，結(jié)果見圖4。

蜜環(huán)菌多糖對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，隨著多糖濃度的增加清除效果逐漸加強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，在1mg·mL-1時清除率為90.52%，且在低濃度下仍保持一定的清除活性。清除DPPH自由基所需的多糖濃度遠(yuǎn)低于其他兩種自由基。

圖4 蜜環(huán)菌多糖、TBHQ和抗壞血酸對DPPH·的清除效果Fig.4 Removed effect of Armillaria mellea，TBHQ and ascorbic acid on DPPH·

3 討論

自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。一般來說，機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可維持自身的自由基平衡，可一旦受到一些不可抗的外界因素如機(jī)體病變、輻射等影響，就會打破這種平衡，造成機(jī)體的損傷與疾病的發(fā)生。因此，從真菌中提取安全高效的多糖作為一種天然抗氧化劑，為蜜環(huán)菌多糖的開發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

本實驗選擇天然抗氧化劑抗壞血酸和合成的抗氧化劑TBHQ作為對照，通過三者之間抗氧化作用的比較，探討了蜜環(huán)菌水溶性多糖對·OH、O2－·和DPPH·三種自由基的清除能力。雖然在清除·OH和DPPH自由基的能力上低于兩個對照，但在一定測試濃度范圍內(nèi)，蜜環(huán)菌多糖仍顯示出了很高的抗氧化能力。

結(jié)果表明，從蜜環(huán)菌粉中提取出的水溶性多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，而這可能是它防衰老、抗炎癥、降血脂等功效的藥理基礎(chǔ)。多糖的抗氧化性能作為一項重要的生理活性指標(biāo)，為完善蜜環(huán)菌藥品及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的依據(jù)。

4 結(jié)論

經(jīng)深層發(fā)酵、濃縮干燥而得到的蜜環(huán)菌菌粉，其水溶性多糖對三種自由基的清除能力有較大差異，以清除能力來比較DPPH·>·OH>O2－·，對DPPH·的清除效果要明顯優(yōu)于其他兩種自由基。在清除率達(dá)到50%時，多糖對·OH、O2－·和DPPH自由基的清除濃度大約為1.5、3.5、0.5mg·mL-1。

本實驗通過三種不同的體外抗氧化體系證明了蜜環(huán)菌水溶性多糖的自由基清除能力，為我們更進(jìn)一步準(zhǔn)確認(rèn)識蜜環(huán)菌多糖類活性物質(zhì)的功效和開展蜜環(huán)菌產(chǎn)品制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供重要參考。

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Study on antioxidant activity of water soluble polysaccharide from Armillaria mellea

ZHU Xian-feng，YU Chen-chen，F(xiàn)AN Shu-jun，QIN Ren-bing，ZHANG Jing-jing
（Institute of Bioengineering and College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004，China）

Objective：The Scavenging effect evaluated the antioxidant activities of the water soluble polysaccharide from Armillaria mellea on hydroxyl（·OH），superoxide anion（O2－·）and 1，1-Dipheny-2-picrylhydrazyl（DPPH）radicals.It provided important reference for activity study and quality standards of Armillaria mellea’s products. Methods：The experiment got the pure polysaccharide by extracted in hot water and removed proteins and other steps.With ascorbic acid and TBHQ as controls，spectrophotometry was used to assess the antioxidant properties.Results：The water soluble polysaccharide had different scavenging abilities on hydroxyl，superoxide anion and DPPH radicals.The scavenging effect of radicals was DPPH>·OH>O2－·.When the scavenging percentage of hydroxyl，superoxide anion and DPPH radicals reached 90%，the polysaccharide concentration was 1.0，5.0，6.0mg·mL-1，respectively.The scavenging ability of polysaccharide was significant.Conclusion：The water soluble polysaccharide had the capable of clear radicals in vitro and exhibited obvious antioxidant activity.In the experimental concentration range，their antioxidant effects showed positive correlation with polysaccharide concentration.Therefore，as an important active substances in nature，the antioxidant activity and anti-aging effects of polysaccharide will have a highly value of application.

Armillaria mellea；water soluble polysaccharide；antioxidant；radical

TS201.1

A

1002-0306（2012）03-0089-04

2010－12－30

朱顯峰（1973－），男，博士，副教授，主要從事微生物與生化藥學(xué)的研究。

河南省科技攻關(guān)計劃項目（102102310016）；河南省高校青年骨干教師資助計劃項目。