華承偉，謝鳳珍，于江傲

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

一種釀酒酵母表達CDNA文庫分離纖維質(zhì)降解酶系基因的方法

華承偉1，謝鳳珍2，于江傲1

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

目的：建立一種篩選自然界產(chǎn)纖維質(zhì)降解酶系基因的新方法。方法：對釀酒酵母表達載體pYES2多克隆位點加入真核生物稀有限制性酶切位點SfiI進行改造，利用SMART技術(shù)，以大腸桿菌文庫為轉(zhuǎn)導(dǎo)，構(gòu)建了擬青霉（Paecilomyces sp.H28）的釀酒酵母全長cDNA表達文庫。結(jié)果：利用纖維質(zhì)-剛果紅染色法從文庫篩選到多種纖維素和半纖維素降解酶系基因。結(jié)論：成功構(gòu)建了擬青霉的釀酒酵母表達cDNA文庫，加快了纖維質(zhì)降解酶系基因的快速分離，也為其它相關(guān)基因的快速分離提供了有益的借鑒。

釀酒酵母，表達cDNA文庫，纖維質(zhì)降解酶，分離，擬青霉

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬青霉（Paecilomyces sp.H28） 由河南科技學(xué)院分離工程實驗室篩選并保藏；釀酒酵母INVSc1（Saccharomyces cerevisiae）及載體pYES2 Invitrogen；Escherichia coli strain JM109 Stratagene；無氨基酸酵母氮源（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids，YNB） Difco；酵母提取物、胰蛋白胨 Oxoid；樺木木聚糖 Sigma；TRIzol ReagentInvitrogen；Oligotex mRNA Mini Kit Qiagen；PrimeScript Reverse Transcriptase（RNase H-），Advantage 2 PCR KitTaKaRa；T4 DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶 NEB；質(zhì)粒提取試劑盒 北京天根生化科技；其它試劑 均為分析純。

1.2 pYES2載體的改造

1.2.1 寡核苷酸單鏈合成 根據(jù)pYES2載體酶切位點，分別合成內(nèi)部具有EcoRI酶切位點且兩端帶有HindIII和XhoI兩個酶切位點粘末端及兩端分別引入SfiI A及SfiI B酶切位點的末端磷酸化的寡核苷酸鏈。

1.2.2 雙鏈DNA合成 用STE緩沖液溶解兩條寡核苷酸鏈，濃度為100μmol/L，分別取等體積的兩鏈溶液50μL混合，置于PCR儀上95℃加熱10min，然后緩慢冷卻到室溫，產(chǎn)物于4℃暫時貯存或-70℃保存。

1.2.3 連接及轉(zhuǎn)化 取約100ng經(jīng)HindIII和XhoI雙酶切的pYES2載體和雙鏈連接產(chǎn)物1.2pmol，T4DNA連接酶1μL，10×連接酶緩沖液1μL，加超純水至總體積10μL，于16℃連接2h。連接產(chǎn)物直接化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪制LB/Amp平板后于37℃培養(yǎng)過夜（12～16h），挑取10個單克隆經(jīng)培養(yǎng)后送交測序公司進行序列測定。測定序列正確的載體命名為pYES2G。

1.2.4 SfiI雙酶切位點的改造 合成兩端帶有6個保護堿基的EcoRI酶切位點的引物，PCR擴增長度約300bp不具有EcoRI酶切位點的任意一基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，EcoRI酶切后連接經(jīng)同樣酶切及去磷酸化的pYES2G載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)PCR驗證及SfiI酶切驗證后，正確的載體命名為pYES2-GSL。

1.3 釀酒酵母表達cDNA文庫的構(gòu)建

1.3.1 總RNA及mRNA的提取 擬青霉（Paecilomyces sp.H28）經(jīng)平板活化后，接種液體培養(yǎng)基于50℃，180r/min條件下培養(yǎng)4d，培養(yǎng)基組成（g/L）：蛋白胨10.0；酵母粉10.0；MgSO4·7H2O 0.2；K2HPO40.87；KH2PO40.68；樺木木聚糖20.0；大麥葡聚糖5.0；CMC-Na 5.0；pH6.5。提取RNA所用的器皿及材料按無RNA酶條件處理。抽濾并用冰冷的DEPC處理的水洗滌菌絲體，稱取0.1～0.3g菌絲體于液氮中快速研磨至無顆粒感，中間不斷加入液氮防止液氮揮發(fā)干凈，研磨后的菌絲體快速移入Trizol中（每0.1g菌絲體加入1mL Trizol），以下操作按Trizol說明書進行。瓊脂糖凝膠變性電泳檢測總RNA質(zhì)量，紫外檢測RNA純度與含量后，利用Oligotex mRNA Mini Kit提取mRNA，具體操作參照試劑盒操作說明。

1.3.2 第一鏈全長cDNA的合成 第一鏈全長cDNA合成所需寡核苷酸引物SMART IV Oligonucleotide和CDS III/3’PCR Primer參照Creator SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech），取500ng mRNA，利用PrimeScript Reverse Transcriptase（RNase H-）合成第一鏈全長cDNA，具體操作見試劑盒說明書。

1.3.3 長距離PCR（LD PCR）擴增全長cDNA 雙鏈全長cDNA合成所需引物5’PCR Primer和CDS III/3’PCR Primer參照Creator SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech）。取第一鏈產(chǎn)物2μL，利用Advantage 2 PCR Kit（TaKaRa）合成雙鏈全長cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化及SfiI酶切后經(jīng)CHROMA SPIN-400 Column分級分離和乙醇沉淀后溶于8μL去離子水，取1μL檢測DNA濃度，產(chǎn)物立即用于下一步連接或貯存于-20℃?zhèn)溆?，具體操作見試劑盒說明書。

1.3.4 雙鏈cDNA與載體pYES2-GSL的連接 取cDNA 2μL，pYES2-GSL（0.1μg）1μL，10×連接酶緩沖液0.5μL，T4DNA連接酶（400U/μL）0.5μL，去離子水1μL，總體積5μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物加入95μL DEPC處理的去離子水和1.5μL糖原（20μg/μL），280μL冰冷的95%乙醇，混勻后于-70℃沉淀2h，15000r/min離心20min，棄去上清，待殘存乙醇揮發(fā)干凈后，沉淀溶于5μL DEPC處理的去離子水。

1.3.5 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coli JM109 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞及轉(zhuǎn)化操作參照文庫構(gòu)建試劑盒，取1μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，用LB液體培養(yǎng)基稀釋至10-6，取100μL涂布LB/Amp平板，檢測重組率及文庫滴度。根據(jù)文庫滴度，涂布LB/Amp平板進行文庫擴增，每個平板加入2mL滅菌的去離子水，用涂布棒輕輕刮掉菌落后用于質(zhì)粒的提取。同時做一個沒有連接載體的空白對照。

1.3.6 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1 釀酒酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞制備參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》[5]，取稀釋后的重組質(zhì)粒5μL（20～50ng），加入冰上融化的80μL釀酒酵母感受態(tài)細胞，輕輕混勻后，冰上放置5min，轉(zhuǎn)入冰冷的0.2cm的電擊杯中進行電擊，電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置：C=25μF；PC=200ohm，V=1.5kV。電擊后立即在電轉(zhuǎn)杯中加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇。取1μL電擊產(chǎn)物，加入100μL 1mol/L山梨醇涂布含有2%棉籽糖的SC-U選擇性平板上（pYES2，Catalog no.V825-20，Version J，2004），用于計算文庫滴度；其余轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別取200μL涂布相應(yīng)的SC-U選擇性平板，用于文庫擴增。30℃培養(yǎng)2～3d，挑取10個菌落PCR檢測重組率。每個平板加入5mL 15%的甘油，輕輕刮掉菌落，于-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 釀酒酵母表達文庫的篩選

取適當(dāng)稀釋的釀酒酵母表達文庫，涂布雙層篩選平板（含有2%半乳糖，2%棉籽糖，1%CMC-Na或木聚糖或大麥葡聚糖的SC-U誘導(dǎo)選擇性平板），30℃，培養(yǎng)3d。每個平板加入適量的0.1%剛果紅溶液，緩慢振蕩染色1h，再用1mol/L的NaCl溶液洗脫，每次洗脫時間為5min，洗脫兩次，觀察有無透明圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 pYES2載體的改造

限制性內(nèi)切酶SfiI在真核生物中極少見到，因此在對釀酒酵母表達載體pYES2多克隆位點（MCS）的改造中引入SfiI酶切位點，合成兩條互補末端磷酸化的寡核苷酸鏈堿基組成見圖1。經(jīng)等摩爾混合，加熱退火后，合成雙鏈DNA，連接HindIII和XhoI雙酶切的載體pYES2，經(jīng)測序鑒定，連接正確的載體命名為pYES2G。

圖1 兩條互補寡核苷酸鏈堿基組成Fig.1 The base composition of two complementary oligonucleotide chain

由于SfiI限制性內(nèi)切酶在酶切時，兩個SfiI位點之間至少需要170bp左右的核酸片段才能獲得最佳的酶切效率[6]，所以合成兩端帶有EcoRI酶切位點的引物，PCR擴增約300bp的插入片段（stuffer fragment），酶切后連接pYES2G，經(jīng)SfiI酶切鑒定后，正確的載體命名為pYES2-GSL（圖2A，圖2B）。

圖2 載體pYES2-GSL圖譜（A）和酶切分析（B）Fig.2 The features of the pYES2-GSL vecto（rA）and enzyme digestion analysis of recombinant pYES2-GSL（B）注：M：marker；1：pYES2-GSL digested with SfiI。

2.2 釀酒酵母表達cDNA文庫的構(gòu)建

圖3 總RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析（A）及雙鏈cDNA電泳（B）Fig.3 Analysis of total RNA by formaldehyde-agarose gel electrophoresi（sA）and ds cDNA by agarose gel electrophoresi（sB）注：M：marker；A1：total RNA；B1：ds cDNA。

2.2.1 總RNA及mRNA的提取及雙鏈cDNA合成 利用Trizol試劑成功從擬青霉（Paecilomyces sp.H28）提取得到總RNA，其1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳顯示（圖3A），28S約為18S的兩倍。其OD260/OD280為1.90，OD260/OD230為1.94，說明提取的總RNA質(zhì)量較好，利用Oligotex mRNA Mini Kit提取mRNA，立即用于反轉(zhuǎn)錄合成全長cDNA第一鏈，或分裝后貯存于-70℃?zhèn)溆?。取約500ng mRNA利用SMART（Switching Mechanism At 5’end of RNA Transcript）法合成全長cDNA第一鏈后，用Advantage 2 PCR Kit擴增形成雙鏈cDNA，PCR產(chǎn)物主要集中在0.5～5kb之間（圖3B），符合建庫要求。

2.2.2 雙鏈cDNA與載體pYES2-GSL的連接與轉(zhuǎn)化 雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化及SfiI酶切后，經(jīng)CHROMA SPIN-400 Column分級分離后（圖4），收集大于500bp的核酸片段，經(jīng)乙醇沉淀濃縮后，連接載體pYES2-GSL。連接產(chǎn)物經(jīng)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli JM109，經(jīng)文庫滴度檢驗，未擴增文庫滴度為2.2×108cfu/mL，重組率為98%，說明以大腸桿菌為宿主的cDNA文庫具有很好的代表性。

圖4 cDNA的分級分離Fig.4 cDNA size fractionation by CHROMA SPIN-400 Column

2.2.3 釀酒酵母表達cDNA文庫的構(gòu)建及篩選 擴增后的文庫經(jīng)質(zhì)粒提取后，經(jīng)適當(dāng)稀釋，分批電轉(zhuǎn)化釀酒酵母，為使文庫具有更好的代表性，需使釀酒酵母文庫庫容達106以上。本研究釀酒酵母電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率達3.1×106/μg DNA，重組率達96%。文庫經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布纖維質(zhì)SC-U誘導(dǎo)平板，經(jīng)剛果紅染色及脫色后，從文庫中篩選到了纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶等多種纖維質(zhì)降解酶系基因。釀酒酵母INSVc1本身所產(chǎn)胞外酶基本不含纖維質(zhì)降解酶系，圖4顯示了篩選到的木聚糖酶菌株與陰性對照菌株的剛果紅染色結(jié)果，雖然pYES2載體及重新改造的pYES2-GSL載體不具有分泌表達功能，但可以通過構(gòu)建全長cDNA文庫，借助蛋白本身信號肽進行分泌表達，雖然這種分泌表達能力較差，但借助一定的篩選手段并結(jié)合序列測定，可以檢測到目標(biāo)蛋白，從而篩選到有用的目標(biāo)基因。

圖5 重組釀酒酵母陰性菌株（A）和木聚糖酶重組釀酒酵母陽性菌株木聚糖剛果紅平板（B）Fig.5 The analysis of recombinant S.erevisiae negative contro（lA）and xylose recombinant S.erevisiae by xylose-Congo red plate（B）

3 結(jié)論

釀酒酵母（S.erevisiae）在釀酒業(yè)和面包業(yè)的使用已有數(shù)千年的歷史，被認為是GRAS（generally recognized as safe）生物[7]，其完整的基因序列也于1996年完成測序，釀酒酵母具有大腸桿菌等原核生物繁殖快、易培養(yǎng)的優(yōu)點，是最早應(yīng)用于基因工程的酵母，是基因表達系統(tǒng)的優(yōu)良宿主菌，至今已廣泛用于表達各種外源基因[8-9]。pYES2為酵母-大腸桿菌多拷貝的穿梭質(zhì)粒，是T7強啟動子控制下的表達載體，通過SMART法合成全長cDNA，克隆進改造的pYES2-GSL載體，利用基因自身編碼信號肽序列，可實現(xiàn)大部分基因尤其是絲狀真菌基因的分泌表達，從而為基因文庫的篩選提供簡便的方法。整個技術(shù)的關(guān)鍵是初級大腸桿菌文庫的滴度要達到108cfu/mL以上及釀酒酵母的轉(zhuǎn)化率至少要達到105/μg DNA，以防文庫信息的丟失。本研究利用構(gòu)建的擬青霉（Paecilomyces sp.H28）釀酒酵母表達文庫篩選得到木聚糖酶、葡聚糖酶和纖維素酶等多種纖維質(zhì)降解酶系相關(guān)基因，同時，釀酒酵母不產(chǎn)生胞外葡糖糖苷酶，也可利用4-甲基傘形基-β-D-葡萄糖苷（4-MUG）等底物顯色法篩選葡萄糖苷酶等糖苷水解酶類。同樣，可利用三嗪染料活性藍F3GA（Cibacron Blue F3GA）染料標(biāo)記木聚糖、葡聚糖和淀粉[10]，雷馬亮藍R（RBB）、活性艷紅等標(biāo)記木聚糖、菊粉和淀粉[11-12]等作為底物來篩選其它多糖降解酶類的基因。

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Method of isolating fiber degrading enzymes gene by S.cerevisiae expression cDNA library

HUA Cheng-wei1，XIE Feng-zhen2，YU Jiang-ao1
（1.School of Life Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China；2.College of Xinke，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China）

Object：Establish a method of isolating fiber degrading enzymes gene.Methods：pYES2 expression vector of Saccharomyces cerevisiae was reconstructed by adding the rare SfiI restriction site in eukaryotes into multiple cloning site（MCS）.Using SMART technology，through Escherichia coli cDNA library，constructed the Saccharomyces cerevisiae full-length cDNA express library of Paecilomyces sp.H28.Results：Using the method of fiber-Congo red stain，screened a variety of cellulose and hemicellulose degrading enzymes genes from the library.Coclusion：Constructed S.cerevisiae cDNA expression library of Paecilomyces successfully. The method speeded up the rate of isolation of fiber-degrading enzymes genes，and provided the beneficial reference for other related genes isolation.

Saccharomyces cerevisiae；expression cDNA library；fiber-degrading enzymes；isolation；Paecilomyces sp.

Q789

A

1002-0306（2012）03-0167-04

纖維質(zhì)是地球上最豐富的可再生的生物質(zhì)資源，纖維質(zhì)主要包括纖維素和半纖維素，對其的綜合利用在解決能源危機、糧食短缺和環(huán)境污染等重大問題上具有深遠的意義。但由于纖維質(zhì)底物的高度復(fù)雜性等原因，纖維質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化、利用與實際應(yīng)用一直有相當(dāng)?shù)木嚯x，纖維質(zhì)的綜合利用是世界難題，也是當(dāng)前高技術(shù)領(lǐng)域競爭的焦點。纖維質(zhì)很難被酶解，其酶解的轉(zhuǎn)換率數(shù)比淀粉低1～2個量級[1]。因此怎樣提高其酶解效率就成為本領(lǐng)域中的關(guān)鍵，微生物來源尤其是真菌來源的纖維素和半纖維素酶系在纖維質(zhì)的生物降解中具有重要的作用，在食品、飼料、化工、制藥及制漿造紙等工業(yè)領(lǐng)域中具有非常廣闊的應(yīng)用前景[2-4]，近年來已受到研究者的廣泛關(guān)注，但傳統(tǒng)的菌種選育和酶學(xué)研究在這方面成就不大。當(dāng)今分子生物學(xué)的快速發(fā)展及生物工程的興起，克隆及表達高效、性能優(yōu)良的纖維質(zhì)降解酶系及利用基因工程和蛋白質(zhì)工程重組、改造纖維質(zhì)降解酶系等，為纖維質(zhì)降解酶系注入了新的活力。迄今，已有上百種相關(guān)基因得到克隆和表達，真菌基因往往由于內(nèi)含子的存在，導(dǎo)致使用傳統(tǒng)的克隆方法耗時、費力且速度較慢。近年來，隨cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)的成熟，從cDNA文庫出發(fā)，大大加快了相關(guān)基因的篩選和克隆，但一般以細菌和噬菌體構(gòu)建的文庫存在篩選方法復(fù)雜及工作量大等缺點，以酵母等真菌直接構(gòu)建的文庫也存在轉(zhuǎn)化效率低，庫容量小等缺點，在實際應(yīng)用中也存在較大問題。本研究利用重新改造的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）穿梭表達載體pYES2構(gòu)建擬青霉（Paecilomyces sp.H28）表達cDNA文庫，利用透明圈法成功篩選到木聚糖酶、葡聚糖酶和纖維素酶等多種纖維質(zhì)降解酶系基因。

2011-03-03

華承偉（1972-），男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

河南科技學(xué)院重點科研項目資助基金。