馬 雯，尹壽偉，唐傳核，楊曉泉

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

酰化對蕓豆分離蛋白熱學特性的影響研究

馬 雯，尹壽偉*，唐傳核，楊曉泉

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

從參與酰化反應基團的視角，運用熱分析（DSC）技術，研究了不同酰化階段蕓豆分離蛋白熱學性質的變化規(guī)律。蕓豆分離蛋白（KPI）的?；^程存在兩個主要的?；A段，酸酐-蛋白比為0~0.1（乙?；┖?~0.2（琥珀酰化）g/g，為ε-氨基（Lys）?；A段（N-?；辉僭黾铀狒c蛋白比，ε-氨基酰化基本完成，反應進入羥基（Thr，Ser）?；A段（O-?；Ｔ贜-?；A段，琥珀?；T導KPI的熱穩(wěn)定性增加，而焓變（ΔH）略有降低，乙?；挥绊慘PI的熱穩(wěn)定性和焓變（ΔH）；羥基?；A段，?；瘜е翶PI變性溫度（Td）降低，伴隨焓變（ΔH）急劇下降。

蕓豆分離蛋白，?；瑹釋W特性

Phaseolus屬豆類是一類豐富而優(yōu)質的植物蛋白資源，具有相對均一的蛋白組成，獨特的結構特點，日益引起國內外食品工作者的關注。蕓豆是Phaseolus屬豆類中具有代表性的蛋白資源，其產量僅次于大豆蛋白。蕓豆籽粒富含的蛋白質（20%~30%干基），氨基酸組成相對較均衡[1]。清蛋白（11.5%~31%）和球蛋白（46%~81%）是蕓豆籽粒的主要貯藏蛋白，其中蕓豆球蛋白（Phaseolin）占總球蛋白的76%以上；另一種球蛋白是植物凝集素[2]。蕓豆球蛋白具有良好的功能特性，而分離蛋白（KPI）功能特性相對較差，這源于分離蛋白制備過程中的酸堿誘導的蛋白構象改變。分離蛋白是豆類蛋白資源（如大豆）的主要利用形式[2]，蕓豆分離蛋白較差的功能特性在一定程度上限制其在食品加工中的應用，因而對蕓豆分離蛋白改性可以增進蛋白資源的利用。此外，較低的消化性能也是制約蕓豆蛋白資源利用的重要因素（Invitrodigestibility）[3]。本研究小組采用?；纳屏耸|豆分離蛋白功能特性和體外消化性能[3]。?；揎椖茱@著改善食物蛋白的功能性，如王月等采用四元二次正交旋轉組合設計實驗法優(yōu)化出琥珀酰化大豆分離蛋白溶解性的最佳工藝條件[4]；王喜波等采用超聲輔助琥珀?；夹g有效提高大豆蛋白的乳化活性[5]。?；纳剖|豆蛋白功能性和消化性能的同時，可能造成蛋白結構構象的改變。琥珀酰化引入帶負電荷的親水性基團，乙酰化過程中引入的是中性的疏水性基團，會導致蛋白分子間/分子內側鏈基團之間的相互作用發(fā)生改變，從而影響到蛋白的熱穩(wěn)定性和有序結構。DSC技術是一種重要的研究蛋白構象穩(wěn)定性和變性程度的技術手段。程序升溫過程中，破壞氫鍵會產生吸熱峰，破壞疏水性相互力或蛋白發(fā)生聚集產生放熱峰[6]。在蛋白的DSC圖譜中，變性溫度（Td）反映蛋白的熱穩(wěn)定性，焓變（ΔH）是指吸熱峰的面積，代表未變性蛋白的比例，與蛋白的有序結構相關[7]。本研究從參與?；磻幕鶊F角度入手，通過探討酸酐與蛋白比對?；|豆分離蛋白熱學特性的影響，建立酰化與蛋白熱穩(wěn)定性（Td）和焓變（ΔH）之間的關聯性，從而為這一類蛋白資源的利用打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕓豆分離蛋白 自制；琥珀酸酐、乙酸酐 購自Sigma公司；其他化學試劑 均為分析純。

Q100 DSC 美國TA Instruments公司；2501PC紫外-可見分光光度計 日本島津；CR22G高速冷凍離心機 日本日立；Alphal-4冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕓豆分離蛋白制備工藝流程 稱取100g脫脂蕓豆粉分散于2L去離子水（1∶20，w/v），用2mol/L NaOH溶液調分散液的pH至8.0，間歇添加NaOH溶液以維持溶液的pH，室溫下攪拌2h后，于20℃離心（12000×g，30min），棄其沉淀物，調節(jié)上清液的pH為4.5，而后于20℃離心（6000×g，20min）。所得沉淀物經兩次水洗后（pH=4.5），分散于適量的去離子水中，用2mol/L的NaOH溶液將pH調到7.0，冷凍干燥后于-20℃貯存?zhèn)溆?。蕓豆分離蛋白（KPI）的蛋白含量為89%（干基）。

1.2.2 酰化處理 琥珀?；鶕﨔ranzen等報道的方法[8]，稍加改動。稱取2g蕓豆分離蛋白分散在80mL去離子水中（蛋白濃度為2.5%，w/v）。在室溫下磁力攪拌1h后，用2mol/L NaOH溶液調節(jié)溶液pH至8.0。向溶液逐漸添加琥珀酸酐，維持溶液的pH在7.5~8.5的范圍。待溶液pH穩(wěn)定在8.0后，再繼續(xù)反應1h，使?；磻耆缓笥?mol/L HCl溶液將溶液pH調至7.0，以終止反應。反應液在4℃透析48h以除去殘余的琥珀酸酐，之后冷凍干燥得到琥珀?；|豆蛋白。對照樣品的制備過程中不添加?；噭阴；鞍椎闹苽溥^程中用乙酸酐代替琥珀酸酐，其余操作與琥珀酰化蛋白制備一樣。

1.2.3 氨基酰化度的測定 氨基?；龋∟-酰化度）的測定根據Habeeb報道的方法[9]，稍作改動。首先，蛋白樣品溶于50mmol/L磷酸緩沖液（含50mmol/L NaCl，pH8.5）中，蛋白濃度為1%（w/v）。添加1mL 0.1%的TNBS溶液到等體積的蛋白溶液中，在60℃保溫2h后，反應液快速冷卻至室溫。順序添加1mL 10%SDS和0.5mL 1mol/L HCl終止反應。在335nm下比色，對照樣品的吸光度值設為100%，用吸光度值降低程度來表征N-?；潭?。

1.2.4 羥基（Ser和Thr）?；葴y定 羥基?；龋∣-?；龋┑臏y定采用Gounaris等報道的堿性羥胺法[10]。將2mol/L NH2OH-HCl溶液，3.5mol/L NaOH溶液和去離子水按2∶1∶1（v/v/v）配制得到測試液。2mL測試液加入1mL蛋白溶液（5mg/mL）中，混合液在40℃下保溫2h后，添加1.0mL 3mol/L HCl以終止反應。添加1.0mL 0.37mol/L FeCl3（在0.1mol/L HCl中）顯色。放置15min后，離心，上清液在540nm條件下比色。用540nm的吸光度值表示O-?；取?/p>

1.2.5 巰基含量測定 巰基含量測定采用經Beveridge改進后的Elman法[11]，稍作改動，巰基?；龋⊿-?；龋轷；鞍椎膸€基含量比上對照樣品的巰基含量。主要試劑配制及測試方法如下：

a.Tris-Gly緩沖液（pH8.0）：精確稱取10.418g Tris，6.756g甘氨酸，1.489g EDTA二鈉，加去離子水定容至1000mL。

b.Tris-Gly-8M Urea溶液：在Tris-Gly緩沖液中加入480.48g尿素。

c.DTNB溶液（4mg/mL）：4mg DTNB試劑溶于1mL Tris-甘氨酸緩沖液（A）。

巰基含量測定：添加15mg蛋白樣品至5.0mL測試液中（B液），添加50μL C溶液，在25℃保溫1h后，于25℃離心（13600×g，10min），上清液在412nm比色。巰基含量的計算公式如下：

SH（μmol/g）=73.53×A412×D/C

式中：A412-除去試劑空白后樣品的吸光度值；D-稀釋倍數；C-蛋白質含量。

1.2.6 熱學特性分析 精確稱取1mg蛋白質放入鋁盒中，加入10μL 10mmol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.0），壓盤。以空鋁盤為對照，溫度掃描范圍：0~120℃，升溫速率：10℃/min，保護氣氮氣流速：50mL/min。采用the universal analyzer 2000軟件計算蛋白質的變性溫度（Td）和焓變（ΔH）。

2 結果與討論

2.1 ?；?/h3>

蛋白的?；磻饕欠肿又械挠H核基團攻擊酸酐的羰基碳原子所誘發(fā)的一類親核取代反應。ε-氨基（Lys）具有較低的pK值和較弱的空間位阻，表現出較強的親核能力。側鏈基團，如酪氨酸的酚羥基及組氨酸的咪唑基團均可以參與?；磻?，但是酰化產物不穩(wěn)定，如酪氨酸酚羥基的?；a物在pH>5情況下分子內催化水解。因而，ε-氨基（Lys）、脂肪族羥基（Thr，Ser）和巰基（Cys）是蕓豆分離蛋白中可能參與?；磻闹饕鶊F。圖1～圖3為蕓豆分離蛋白中這三種側鏈基團參與?；磻那闆r。

N-?；纫蕾囉趨⑴c反應的?；噭┓N類和用量。在乙酸酐與蛋白比低于0.1g/g時，N-?；入S酸酐與蛋白比增加而迅速增加，乙酸酐與蛋白比為0.1g/g時達到93%~94%，酸酐與蛋白比再繼續(xù)增加，N-?；葍H增加2%~3%。琥珀?；瘸尸F出與乙酰化度相似的變化趨勢，只是琥珀?；冗_到93%~94%需要的酸酐與蛋白比較乙?；?，為0.2g/g（圖1）。在相同酸酐與蛋白比的情況下，尤其在低于0.2g/g時，乙酰蛋白具有較高的?；龋砻饕宜狒如晁狒哂懈鼜姷幕钚?，這主要歸因于乙酸酐具有較小的空間位阻效應。

圖1 酸酐與蛋白比對N-?；鹊挠绊憟DFig.1 Influence diagram of anhydride and protein ratio on N-acylation degree

圖2 N-?；扰cO-酰化度之間的關系Fig.2 Relationship of N-acylation degree and O-acylation degree

圖3 N-?；扰cS-酰化度之間的關系Fig.3 Relationship of N-acylation degree and S-acylation degree

圖2顯示，ε-氨基（Lys）與羥基（Ser和Thr）具有一定的競爭性，ε-氨基具有更強的活性。在N-?；鹊陀?3%~94%時，即酸酐與蛋白比低于0.1g/g（乙?；┗?.2g/g（琥珀?；r，羥基（Ser和Thr）不參與?；磻瑓⑴c?；磻幕鶊F主要是Lys的ε-氨基，反應產物主要是N-酰化產物；而當Lys的ε-氨基的N-?；冗_到93%~94%，再繼續(xù)增加酸酐與蛋白比例，N-酰化度僅增加2%~3%，羥基（Ser和Thr）開始參與酰化反應（見圖1、圖2）。

隨著ε-氨基?；磻倪M行，巰基逐步參與反應，這與Franzen、Kinsella的報道不一致[8]，他們認為，大豆蛋白中的巰基幾乎不參與?；磻?。兩種蛋白的巰基參與?；磻慕Y果差異，主要源于巰基在蛋白分子中的分布差異。蕓豆分離蛋白巰基分布于分子表面，較低的空間位阻效應有利于其參與酰化反應[12]；而在大豆蛋白中巰基主要分布在分子內部，不利于?；磻倪M行。

2.2 DSC分析

?；|豆分離蛋白熱學特性DSC技術研究見圖4~圖6。在對照樣品的DSC圖譜上，呈現出一個明顯的吸熱峰，歸屬為蕓豆球蛋白（phaseolin）的變性（圖4）。?；瘜κ|豆分離蛋白熱穩(wěn)定性（Td）的影響依賴于所用的試劑種類以及酰化反應所處的階段。在Lys的ε-氨基?；A段，琥珀?；T導蕓豆分離蛋白的Td（反映熱穩(wěn)定性）從91.1℃逐漸增加至95.70~96.2℃；在羥基?；A段，Td逐漸下降至92.2℃。在ε-氨基（Lys）?；磻A段，帶負電荷的琥珀酰基團取代帶正電荷的ε-氨基（Lys），導致蕓豆蛋白表面負電荷堆積（電負性劇增）。因此琥珀?；鞍追肿娱g的靜電排斥效應抑制程序升溫過程中的蛋白-蛋白相互作用，而蛋白-蛋白聚集物的形成導致蛋白不可逆變性。乙?；c琥珀酰化存在著較大的差異，ε-氨基（Lys）的酰化階段，乙?；|豆分離蛋白的Td與對照相似或略高；而羥基?；A段，乙?；|豆分離蛋白的Td逐漸下降。當酸酐與蛋白比達到1.0g/g，乙酰化蕓豆分離蛋白的DSC圖譜上的吸熱峰消失，表明蛋白完全變性；而在琥珀?；|豆分離蛋白的DSC圖譜上，除在92.20℃出現一個吸熱峰外，在77.5℃時呈現了一個焓變僅為0.21J/g的弱的吸熱峰（圖5），表明廣泛的琥珀?；瘜е率|豆分離蛋白構象改變，出現具有不同構象狀態(tài)的蛋白組分。這一點在native-PAGE圖譜中得到印證，較低的遷移率處出現了一條額外的蛋白譜帶[13]。羥基（Ser和Thr）酰化階段，琥珀?；鸵阴；瘜е碌鞍椎臒岱€(wěn)定性降低，這與熒光光譜分析結果一致[13]。

圖4 對照和?；|豆分離蛋白的DSC圖譜Fig.4 DSC map of isolate protein in control and acylation kidney bean

圖5 琥珀?；|豆分離蛋白的DSC圖譜Fig.5 DSC map of isolate protein in succinylation kidney bean注：酸酐與蛋白比為1.0g/g。

焓變（ΔH）是蛋白熱學特性的一個重要指標。圖6給出了在不同?；A段，蕓豆分離蛋白焓變的變化規(guī)律。在ε-氨基?；A段，琥珀?；鸵阴；尸F不同的變化趨勢，琥珀酰化蕓豆分離蛋白的焓變，隨N-酰化度增加從14.17降至9.25J/g；而乙酰化情況，蛋白的焓變基本上保持不變（圖6A）；在羥基?；A段，隨O-?；仍黾?，琥珀?；鸵阴；|豆分離蛋白的焓變均逐漸降低（圖6B）。

圖6 ?；|豆蛋白的焓變與N-酰化度（A）和O-?；龋˙）之間的關系Fig.6 The relationship of acylation kidney bean protein enthalpy change，N-acylation degree（A）and O-acylation degree（B）

3 結論

3.1 蕓豆分離蛋白的?；^程存在兩個主要的酰化階段，在酸酐-蛋白比為0~0.1（乙酰化）g/g和0~0.2（琥珀?；ゞ/g時，N-?；葟?迅速增加至93%~ 94%，為Lys的氨基?；A段；再增加酸酐與蛋白比，羥基（Thr，Ser）才開始參與?；磻瑸榱u基（Thr，Ser）?；A段。

3.2 ε-氨基?；A段，琥珀酰化誘導KPI的變性溫度（反映熱穩(wěn)定性）從91.1℃逐漸增加至95.70~96.2℃，乙?；疜PI的熱穩(wěn)定性基本不變；羥基?；A段，琥珀?；疜PI的變性溫度逐漸下降至92.2℃，乙?；|豆分離蛋白的變性溫度逐漸下降。

3.3 在Lys的ε-氨基的?；A段，KPI的構象基本上不變；羥基?；瘜е率|豆分離蛋白分子伸展和變性，酸酐與蛋白比為1.0g/g，乙?；瘜е翶PI完全變性，而琥珀?；斐蒏PI出現不同構象狀態(tài)的組分。

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Study on effect of acylation on thermal properties of kidney bean（Phaseolus vulgaris L.）protein isolate

MA Wen，YIN Shou-wei*，TANG Chuan-he，YANG Xiao-quan
（Department of Food Science and Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The objective was to investigate the acylation-induced change in thermal properties of kidney bean protein isolate（KPI）by differential scanning calorimetry（DSC）techneques.The possible reactive amino groups of proteins，taking part in the acylation of KPI were explored.The relationships between thermal properties of acylated KPI and acylated stage were established.The data indicated that the acylation of KPI included two stages.One was the acylation of ε-amino groups（N-acylation），the other was the acylation of hydroxyl groups（O-acylation）.In the N-acylation stage，the degree of the N-acylation sharply increased to about 93%～94% with the anhydride levels increasing from 0 to 0.1（acetylation）or 0.2g/g（succinylation）.The O-acylation（Thr，Ser）distinctly occurred only when the N-acylation was nearly completed.In the N-acylation case，succinylation led to the increases in the thermal stability，the decreases in the enthalpy changes（ΔH），while the Tdand the ΔH of KPI were unaffected by the acetylation.In the O-acylation case，the acylation led to the decreases in Tdof KPI，accompanied with the sharp decrease in ΔH.

kidney bean protein isolate；acylation；thermal properties

TS210.1

A

1002-0306（2012）07-0092-04

2011－05－27 *通訊聯系人

馬雯（1987-），女，碩士，研究方向：糧油及植物蛋白工程。

廣東省自然基金博士啟動項目（104510064101005149）。