魏 東 盧錦標(biāo) 王國治

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

炭疽雙組分疫苗的研究

魏 東 盧錦標(biāo) 王國治▲

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

目的 通過研究由重組炭疽保護(hù)性抗原與滅活炭疽芽孢桿菌菌體抗原組成的炭疽候選疫苗免疫小鼠，對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法 將小鼠隨機(jī)分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采血進(jìn)行抗體檢測(cè)、MTT法淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、ELISPOT法IFN-γ細(xì)胞因子的測(cè)定以及保護(hù)力試驗(yàn)。 結(jié)果 各組疫苗均能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。第3周rPA組及rPA＋炭疽菌體組經(jīng)rPA抗原刺激后的刺激指數(shù)均高于對(duì)照組（P＜0.05）。ELISPOT結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)特異性抗原刺激后均有較高的IFN-γ分泌。rPA抗原與炭疽菌體抗原有較好的保護(hù)力，由rPA與炭疽菌體組成的疫苗對(duì)炭疽活芽孢的攻擊保護(hù)率為100%。 結(jié)論 由rPA抗原與滅活炭疽菌體抗原組成的新型炭疽疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有較好的保護(hù)力，該疫苗有希望成為新一代炭疽疫苗。

炭疽疫苗；保護(hù)性抗原；體液免疫；細(xì)胞免疫

我國現(xiàn)用炭疽疫苗為減毒活疫苗[1]，成分為去除莢膜質(zhì)粒pXO2的減毒活芽孢。該疫苗采用皮上劃痕方式接種，難以保證有效接種劑量?；钜呙缇哂幸欢堄喽拘裕瑖鈱?duì)該疫苗使用仍存在一定爭(zhēng)議。目前，美國使用的炭疽疫苗為AVA疫苗，由炭疽培養(yǎng)液經(jīng)除菌過濾后加氫氧化鋁佐劑吸附制備而成，其主要成分是保護(hù)性抗原（protective antigen，PA）。該疫苗免疫程序周期過長(zhǎng)，保護(hù)期短，需18個(gè)月內(nèi)肌內(nèi)注射5次，每年需加強(qiáng)免疫1次[2]。當(dāng)前，對(duì)PA在新型炭疽疫苗設(shè)計(jì)中的主導(dǎo)作用已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，PA對(duì)疫苗的保護(hù)力起關(guān)鍵作用[3-5]?，F(xiàn)有研究同時(shí)表明，活疫苗的保護(hù)效果好于以PA為主的炭疽疫苗，說明除PA外還有其他抗原成分對(duì)疫苗保護(hù)效果起重要作用[6]。

炭疽桿菌極有可能被用作生物戰(zhàn)劑和制造生物恐怖[7]，對(duì)社會(huì)穩(wěn)定造成極大威脅，所以各國都在研制更為安全有效的新疫苗。炭疽芽孢桿菌在生命周期具有不同形態(tài)，從芽孢出芽增殖，到營養(yǎng)態(tài)菌體細(xì)胞，再到休眠體芽孢，可能存在不同的具有保護(hù)作用的抗原[8-11]。本研究以重組保護(hù)性抗原（recombinant protective antigen，rPA）為主要成分[12]，加滅活入炭疽菌體抗原，設(shè)計(jì)新型炭疽疫苗，并以小鼠作為模型，對(duì)炭疽疫苗的免疫學(xué)作用進(jìn)行初步研究，為新型炭疽疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

Al（OH）3佐劑由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗二室提供，rPA抗原、滅活炭疽菌體抗原由中國食品藥品檢定研究院細(xì)菌一室提供。MTT（美國Sigma公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；ELISPOT小鼠IFN-γ檢測(cè)試劑盒（瑞典Mabtech公司）豚鼠由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。MK3酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Dragon公司）ELISPOT自動(dòng)讀板儀（美國CTL公司）。

1.2 分組及免疫

將80只6～8周齡的Balb/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組20只。（1）Al（OH）3佐劑對(duì)照組；（2）rPA組（10 μg/0.2 mL/只）；（3）炭疽菌體組（1億菌 /0.2 mL/只）；（4）rPA ＋炭疽菌體組（劑量同前）。分別在第0、2周免疫，注射部位均為后肢肌內(nèi)。分別于第3、4周每組取5只動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。用淋巴細(xì)胞分離液分離脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT和MTT等細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測(cè)，將分離的血清做ELISA體液免疫應(yīng)答的檢測(cè)。

1.3 抗體檢測(cè)

包被抗原，rPA包被濃度為5 μg/mL，炭疽菌體濃度均為1億/mL，4℃過夜。封閉液封閉1 h后，每孔加入100 μL的50倍開始倍比稀釋的待檢血清，按ELISA操作步驟分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，底物顯色，終止反應(yīng)，并在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)吸光值A(chǔ)450。

1.4 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTT法）

分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL 2.5×106/mL濃度的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液稀釋rPA抗原為20 μg/mL，炭疽菌體抗原濃度均為0.1 億/mL。試驗(yàn)孔各加100 μL，均做復(fù)孔，同時(shí)用完全培養(yǎng)液作陰性對(duì)照，ConA作陽性對(duì)照。在37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每孔加入 15 μL MTT（5 mg/mL），于 37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清液，加入100 μL細(xì)胞裂解液后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值A(chǔ)570/630，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，參考波長(zhǎng)630 nm。計(jì)算復(fù)孔的A570/630平均值，計(jì)算刺激指數(shù)（SI），（SI=實(shí)驗(yàn)孔A570/630/陰性對(duì)照孔A570/630）。

1.5 脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ的測(cè)定

取96孔IFN-γ檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞及抗原操作同1.4。于37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48 h后，按ELISPOT操作依次加入檢查抗體等試劑，洗板，顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。

1.6 保護(hù)力試驗(yàn)

第2次免疫后2周，每組取10只小鼠，腹腔注射弱毒株炭疽芽孢6億/只。每天觀察小鼠狀態(tài)，連續(xù)觀察14 d。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 抗體效價(jià)結(jié)果

2.1.1 抗rPA抗體結(jié)果 rPA組和rPA+炭疽菌體組均能誘導(dǎo)產(chǎn)生PA抗體，各組第4周的rPA抗體效價(jià)較第3周均有小幅增加。第3周rPA組小鼠血清中的rPA抗體高于rPA+炭疽菌體組（P＜0.05）。第4周兩組rPA抗體效價(jià)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 抗rPA抗原IgG抗體效價(jià)

2.1.2 抗炭疽菌體抗體結(jié)果 炭疽菌體組和rPA+炭疽菌體組都可產(chǎn)生高效價(jià)的抗炭疽菌體抗體，且第4周較第3周抗體效價(jià)均有升高趨勢(shì)，各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 抗炭疽菌體抗原IgG抗體效價(jià)

2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果

第3周rPA組及rPA+炭疽菌體組經(jīng)rPA抗原刺激后的刺激指數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。炭疽菌體組及rPA+炭疽菌體組經(jīng)炭疽菌體抗原刺激后的刺激指數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。第4周各組間比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 第3周脾臟淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果

2.3 ELISPOT測(cè)定IFN-γ結(jié)果

2.3.1 第3周ELISPOT結(jié)果 rPA組及rPA+炭疽菌體組經(jīng)rPA抗原刺激后產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。炭疽菌體抗原的刺激作用較為強(qiáng)烈，由于孔中斑點(diǎn)數(shù)太多，儀器無法計(jì)數(shù)，見表1。

表1 第3周抗原刺激后IFN-γ斑點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果（2.5×105 cell）

2.3.2 第4周ELISPOT結(jié)果 除了rPA組，其他實(shí)驗(yàn)組經(jīng)各種抗原刺激后產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表2。

表2 第4周抗原刺激后IFN-r斑點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果（2.5×105 cell）

2.4 保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果

每只小鼠在6億炭疽活芽孢的攻擊下，除對(duì)照組外其余各組保護(hù)率均為100%，結(jié)果見表3。這表明，除rPA外，炭疽菌體抗原對(duì)小鼠的免疫保護(hù)也起著重要作用。

表3 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果（存活數(shù)/總數(shù)）

3 討論

以PA為主要成分疫苗保護(hù)力來自其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對(duì)炭疽毒素的中和作用，但其對(duì)炭疽芽孢桿菌在體內(nèi)的繁殖及毒素分泌沒有直接抑制作用，而且炭疽毒素是由炭疽菌體分泌產(chǎn)生。如果疫苗中加能入抑制炭疽菌體繁殖的成分，有可能提高疫苗的保護(hù)效果[13-14]。本研究以PA為主要成分輔以滅活炭疽菌體抗原，設(shè)計(jì)新型炭疽疫苗，以小鼠作為模型，對(duì)新型炭疽疫苗的免疫學(xué)作用進(jìn)行初步研究。

在細(xì)胞免疫檢測(cè)方面采用了淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和ELISPOT試驗(yàn)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是通過檢測(cè)特異性抗原刺激后細(xì)胞增殖來評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答。rPA抗原體外能刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，第3周的試驗(yàn)中，rPA組和rPA+炭疽菌體組經(jīng)rPA抗原刺激后的刺激指數(shù)均高于對(duì)照組。ELISPOT試驗(yàn)是通過檢測(cè)特異性抗原刺激后分泌細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞數(shù)量來評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫后經(jīng)不同刺激物刺激后產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)均高于對(duì)照組，說明新型疫苗能誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)來評(píng)價(jià)體液免疫應(yīng)答。對(duì)于主要在細(xì)胞外生長(zhǎng)的細(xì)菌，有效的體液免疫應(yīng)答能起到重要的保護(hù)作用。rPA組和rPA+炭疽菌體組均能誘導(dǎo)產(chǎn)生PA抗體。炭疽菌體可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，炭疽菌體組和rPA+炭疽菌體組都可產(chǎn)生較高效價(jià)的抗炭疽菌體抗體。

保護(hù)力試驗(yàn)中每只小鼠腹腔注射6億炭疽活芽孢進(jìn)行攻擊，除對(duì)照組外其余各組保護(hù)率均為100%。單純的炭疽菌體能提供很好的保護(hù)作用，提示在以PA為主要成分的基礎(chǔ)上，輔以滅活炭疽菌體成分，有可能提供更全面的保護(hù)。由于實(shí)驗(yàn)條件所限，攻毒菌株采用炭疽弱毒菌株，有待使用強(qiáng)毒株進(jìn)行攻擊試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證新型炭疽疫苗的保護(hù)效果。但從目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，rPA與滅活炭疽菌體抗原除成的雙組分疫苗是一種有希望的炭疽疫苗。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典（三部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：74-76.

[2] Pittman PR，Kim-Ahn G，Pifat DY，et al. Anthrax vaccine: immunogenicity and safety of a dose-reduction, route-change comparison study in humans[J].Vaccine，2002，20（9-10）：1412-1420.

[3] Kaur M，Bhatnagar R.Recent progress in the development of anthrax vaccines[J].Recent Pat Biotechnol，2011，5（3）：148-159.

[4] Peachman KK，Li Q，Matyas GR，et al. Anthrax vaccine antigen-adjuvant formulations completely protect New Zealand white rabbits against challenge with Bacillus anthracis Ames strain spores[J].Clin Vaccine Immunol，2012，19（1）：11-16.

[5] Little SF，Ivins BE，Webster WM，et al. Effect of aluminum hydroxide adjuvant and formaldehyde in the formulation of rPA anthrax vaccine[J].Vaccine，2007，25（15）：2771-2777.

[6] Little SF，Knudson GB.Comparative efficacy of Bacillus anthracis live spore vaccine and protective antigen vaccine against anthrax in the guinea pig[J].Infect Immun，1986，52（2）：509-512.

[7] Inglesby TV，O'Toole T，Henderson DA，et al. Anthrax as a biological weapon,2002:updated recommendations for management[J].JAMA，2002，287（17）：2236-2252.

[8] Gauthier YP，Tournier JN，Paucod JC，et al. Efficacy of a vaccine based on protective antigen and killed spores against experimental inhalational anthrax[J].Infect Immun，2009，77（3）：1197-1207.

[9] Lee DY，Chun JH，Ha HJ，et al. Poly-gamma-d-glutamic acid and protective antigen conjugate vaccines induce functional antibodies against the protective antigen and capsule of Bacillus anthracis in guinea-pigs and rabbits[J].FEMS Immunol Med Microbiol，2009，57（2）：165-172.

[10] Brahmbhatt TN，Darnell SC，Carvalho HM，et al. Recombinant exosporium protein BclA of Bacillus anthracis is effective as a booster for mice primed with suboptimal amounts of protective antigen[J].Infect Immun，2007，75（11）：5240-5247.

[11] Brossier F，Levy M，Mock M.Anthrax spores make an essential contribution to vaccine efficacy[J].Infect Immun，2002，70（2）：661-664.

[12] Jinbiao Lu，DongWei，YefuWang，et al. High-level expression and singlestep purification of recombinant Bacillus anthracis protective antigen from Escherichia coli[J].Biotechnol Appl Biochem，2009，52（Pt2）：107-112.

[13] Cybulski RJ Jr，Sanz P，McDaniel D，et al. Recombinant Bacillus anthracis spore proteins enhance protection of mice primed with suboptimal amounts of protective antigen[J].Vaccine，2008，26（38）：4927-4939.

[14] Enkhtuya J，Kawamoto K，Kobayashi Y，et al. Significant passive protective effect against anthrax by antibody to Bacillus anthracis inactivated spores that lack two virulence plasmids[J].Microbiology，2006，152（Pt10）：3103-3110.

Research of the immunological response of anthrax candidate vaccine

WEI Dong LU Jinbiao WANG Guozhi
National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

ObjectiveTo evaluate the immune response of a new anthrax candidate vaccine,which is composed of recombinant PA antigen and somatic antigen of vegetative Bacillus anthracis.MethodsMice were randomly divided into four experimental groups, and they were tested at different times for serum ELISA,MTT cell proliferation, ELISPOT and efficacy test.ResultsELISA results showed that all groups can induce humoral immunoresponse. Lymphocyte proliferation was detected on the 3rd week in groups containing rPA. ELISPOT result showed that the number of spleen lymphocytes which secreted IFN-γ after stimulated with specific antigen was higher in experimental groups than control group. Mice immunized with rPA and somatic antigen were fully protected against an intraperitoneal challenge with live Bacillus anthracis spores.ConclusionThe new anthrax candidate vaccine composed of rPA and somatic antigen can induce significant humoral and cellular immune response, which would be a new generation of anthrax vaccine.

Anthrax vaccine; Protective antigen; Humoral immunity; Cellular immunity

R392

A

2095-0616（2012）11-24-03

國家科技重大專項(xiàng)課題（2009ZX10004-804）?！?/p>

2012-04-18）