趙軍軍 李孝壁 馬平平 孔雙華 楊寶海 王春玲

江蘇豪森醫(yī)藥研究院有限公司，江蘇連云港 222000

HPLC法測定鹽酸吉西他濱的有關(guān)物質(zhì)

趙軍軍 李孝壁 馬平平 孔雙華 楊寶海 王春玲

江蘇豪森醫(yī)藥研究院有限公司，江蘇連云港 222000

目的改進(jìn)鹽酸吉西他濱有關(guān)物質(zhì)的測定方法。方法采用迪馬 C8（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，梯度洗脫檢查，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長275 nm。結(jié)果在0.005～2.402μg/mL范圍線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999（n=5）,重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜0.000 5%（n=6）。結(jié)論本方法簡單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于鹽酸吉西他濱的有關(guān)物質(zhì)檢查。

鹽酸吉西他濱；有關(guān)物質(zhì)；HPLC

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）化學(xué)名2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷（β-異構(gòu)體），是一種阿糖胞苷類似物，屬于新型抗嘧啶核苷酸代謝化療藥物，屬細(xì)胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，即S期細(xì)胞。在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進(jìn)展；具有抗瘤譜廣、作用機(jī)制獨(dú)特、毒性反應(yīng)低、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應(yīng)無疊加等特點(diǎn)。在過去的臨床工作中，筆者觀察到鹽酸吉西他濱是療效較好而毒副反應(yīng)較少的化療藥物之一[1-2]。有關(guān)物質(zhì)直接反映藥品的安全性，本研究采用高效液相色譜法[3-4]對有關(guān)物質(zhì)[5-6]的檢查進(jìn)行了詳細(xì)的研究。

1 儀器與試劑

儀器：電子分析天平，梅特勒XS105；Agilent 1200系列（G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314B VWD，G1315D DAD）；Agilent化學(xué)工作站；色譜柱：辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（迪馬C8250 mm×4.6 mm，5μm）。

試劑：磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸均為分析純是國藥集團(tuán)化學(xué)試劑股份有限公司生產(chǎn)；純化水由本公司生產(chǎn)；甲醇為色譜純，德國MERCK公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)過程與結(jié)果

2.1 色譜條件（表1）

照高效液相色譜法，用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（迪馬C8250 mm×4.6 mm，5μm）；以磷酸二氫鈉溶液（稱取15.6 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）溶解在900 mL水里，加2.5 mL磷酸，加水稀釋至1 000 mL，搖勻）作為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B；進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為275 nm；流速為每分鐘1 mL。

表1 色譜條件

2.2 系統(tǒng)專屬性試驗(yàn)

配制含有α-異構(gòu)體的系統(tǒng)適用性溶液，作為溶液A，量取20 μL進(jìn)樣，RRT=0.7處能檢測到α-異構(gòu)體；稱取鹽酸吉西他濱（含有3’-鹽酸吉西他濱差向異構(gòu)體）配制成濃度為2 mg/mL的溶液，作為溶液B，量取20μL進(jìn)樣，在RRT=0.9處能檢測到3’-鹽酸吉西他濱差向異構(gòu)體；稱取胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.05 mg/mL的溶液，作為溶液C，量取20μL進(jìn)樣；精密稱取鹽酸吉西他濱標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的溶液，置于90℃水浴中加熱4 h，靜置，冷卻至室溫，作為溶液D，量取20μL進(jìn)樣，在RRT=1.9處能檢測到熱降解雜質(zhì)；精密稱取鹽酸吉西他濱標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的溶液，移取2 mL至20 mL量瓶中，加入9 mL 30%雙氧水，靜置3 d，作為溶液E，量取20μL進(jìn)樣，在RRT=0.8處能檢測到氧化雜質(zhì)；溶液A 2 mL+溶液B 2 mL+溶液C 0.5 mL+溶液D 2 mL+溶液E 2 mL混合作為溶液F，精密量取溶液F 20μL進(jìn)樣，考察各雜質(zhì)與吉西他濱的的分離情況。各雜質(zhì)的分離情況見表2。專屬性圖見圖1。

表2 方法專屬性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 方法專屬性色譜圖

2.3 定量限與檢測限

分別配制每毫升中約含鹽酸吉西他濱2 mg、胞嘧啶0.2 mg、α-異構(gòu)體1 mg的溶液，逐步稀釋，進(jìn)樣，至信噪比（S/N）為3左右為檢測限，至信噪比為10左右為定量限； 配制每毫升中約含鹽酸吉西他濱（含有3’-鹽酸吉西他濱差向異構(gòu)體）2 mg的溶液，進(jìn)樣至3’-鹽酸吉西他濱差向異構(gòu)體信噪比為3左右為檢測限，至信噪比為10左右為定量限。見表3。

表3 檢測限與定量限

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

按照標(biāo)準(zhǔn)限度濃度配制線性試驗(yàn)溶液，胞嘧啶在0.005～2.402μg/mL，α- 異構(gòu)體在 0.011～2.156μg/mL，3’-差向異構(gòu)體在0.023～2.774μg/mL，測定結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)皆不小于0.999，說明本方法線性良好。見表4。

2.5 重復(fù)性

精密稱取鹽酸吉西他濱樣品50 mg，置于25 mL量瓶中，用水溶解并稀釋到刻度，搖勻；平行6份，按照所確定的方法進(jìn)行測定。見表5。

表4 線性關(guān)系

2.6 溶液穩(wěn)定性

取鹽酸吉西他濱適量,用水溶解并稀釋制成每毫升約含2 mg的溶液?？疾烊芤涸?4 h的穩(wěn)定性。見表6。

2.7 方法耐用性

按下表所列將緩沖溶液的pH值，緩沖溶液與甲醇比例，柱溫，柱批次進(jìn)行微小的變化，精密量取鹽酸吉西他濱系統(tǒng)適用性溶液20μL進(jìn)樣，察看主峰的保留時(shí)間RT，計(jì)算理論塔板數(shù)N，拖尾因子T，鹽酸吉西他濱和α-異構(gòu)體的分離度R察看方法的耐用性。見表7。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表7 方法耐用性

3 討論

本研究建立了有關(guān)物質(zhì)的測定方法，并通過對雜質(zhì)的專屬性、檢測限、定量限、線性范圍、重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性、方法耐用性等項(xiàng)目的考察，充分說明本研究確定的方法能有效準(zhǔn)確地測定鹽酸吉西他濱中可能存在的有關(guān)物質(zhì)。

[1]李留樹，王如良.非小細(xì)胞肺癌的治療進(jìn)展[J].解放軍保健醫(yī)學(xué)雜志，2011，3：199-200.

[2]陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：675-676.

[3]劉文英.藥物分析[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：81-84.

[4]張數(shù)秀，曹志勝，惠秋莎.最新藥品注冊工作指南[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2007：64-70.

[5]國家藥典委員會(huì).中國藥典二部附錄[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：54.

[6]國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則//藥品研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：155.

Determination of gemcitabine hydrochloride and its related substances by HPLC

ZHAO Junjun LI Xiaobi MA Pingping KONG Shuanghua YANG Baohai WANG Chunling

Jiangsu Hansoh Medicine Research Institute Co.,Ltd,Lianyungang 222000,China

ObjectiveTo improve the determination of related substances in gemcitabine hydrochloride.MethodsThe determination was carried out on a Dikma C8(250 mm×4.6 mm,5μm)column with gradient elution.The detection wavelength of UV detector was 275 nm.ResultsThere was a good linearity over the range of 0.005-2.402μg/mL with a the correlation coefficient higher than 0.999(n=5).The RSD for repeatition was less than 0.0005%(n=6).ConclusionThe method was simple,accurate and good reproducibility,which can be used for the determination of related substances for gemcitabine hydrochloride.

Gemcitabine hydrochloride;Related substances;HPLC

R-33

B

2095-0616（2012）18-106-03

2012-06-05）