于西佼，唐開(kāi)亮，杜 毅，李 紓

(山東 濟(jì)南 250001:1.濟(jì)南市口腔醫(yī)院牙體牙髓科;2.山東大學(xué)省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

Bcl－2是目前已被確認(rèn)的凋亡調(diào)控抑制蛋白，Tsujimoto等［1］(1984)從人14號(hào)和18號(hào)染色體易位的濾泡性淋巴瘤中分離出的一種原癌基因，編碼Mr 26000蛋白，分布于線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。Bcl－2可促進(jìn)細(xì)胞的存活而減少凋亡的發(fā)生，抑制多種基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并在不影響細(xì)胞增殖的情況下增強(qiáng)細(xì)胞存活力，參與細(xì)胞增殖和凋亡動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控。

本研究通過(guò)制備不同發(fā)育階段的BALB/C小鼠下頜第一磨牙牙胚標(biāo)本，采用TUNEL法和PV免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)凋亡調(diào)控抑制蛋白Bcl－2在成釉細(xì)胞分化、分泌過(guò)程中的表達(dá);透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，以期探討B(tài)cl－2和細(xì)胞凋亡在該過(guò)程的可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

鼠PCNA單克隆抗體、PV免疫組化兩步法試劑盒、DAB顯色劑(北京中杉);多聚賴氨酸(Sigma美國(guó));RM2135切片機(jī)(LEICA，德國(guó));OLYMPUS CX71顯微鏡和照相系統(tǒng)、JEM－1200EX透射電鏡(日本)。

1.2 標(biāo)本制備

取出生后 2、5、7、9、14 d 不同發(fā)育階段的BALB/C小鼠下頜第一磨牙牙胚(山東大學(xué)動(dòng)物中心提供)25只，分別于麻醉后用新鮮配置的40 g/L多聚甲醛內(nèi)固定，解剖分離下頜骨，40 g/L多聚甲醛 4℃下再固定1 d、100 g/L EDTA脫鈣1～2個(gè)月，梯度乙醇脫水、石蠟包埋，近中遠(yuǎn)中向5 μm連續(xù)切片，行HE和免疫組化。

1.3 免疫組化

采用PV免疫組化法對(duì)Bcl－2表達(dá)進(jìn)行組織定位。常規(guī)石蠟切片脫蠟、水化至水，30 mL/L過(guò)氧化氫液室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加Bcl－2單克隆抗體(1∶100稀釋)，37℃溫箱孵育1 h。PBS洗2 min×3次，滴羊抗鼠IgG抗體－HRP多聚體，37℃孵育20 min，PBS漂洗，DAB液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染30 s，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并照相。(陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色)。陰性對(duì)照片用PBS分別代替一抗或二抗，以成骨肉瘤組織作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 原位末端標(biāo)記(TdT－mediated－dUTP nick end labeling，TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化至水，30 mL/L過(guò)氧化氫液溫處理7 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。DDW(double distilled water)沖洗，0.1 mol/L PBS液(pH 7.4)2 min × 3 次;用 16.2 μg/mL 蛋 白 酶 K(10 mmol/L Tris/HCI pH 7.4)在37℃溫箱孵育消化10 min，DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次;每個(gè)標(biāo)本加入20 μL的TUNEL反應(yīng)液(1號(hào)液與2號(hào)液按1∶9混合配制，1號(hào)液為末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶TdT，2號(hào)液為核苷酸混合液)放于濕盒中37℃ 溫箱孵育60 min，DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次;此時(shí)在熒光顯微鏡下觀察并分析結(jié)果后，加入酶標(biāo)記的抗熒光素抗體轉(zhuǎn)化劑－POD(3號(hào)液)，濕盒內(nèi)37℃溫箱孵育30 min，DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次;正常山羊血清室溫處理10 min以減少非特異性結(jié)合，PBS洗 2 min×3次;加入DAB顯色劑鏡下顯色，DDW終止顯色反應(yīng)，沖洗，蘇木精復(fù)染30 s，自來(lái)水沖洗5 min，常規(guī)脫水封片，鏡下觀察并照相。以2號(hào)液代替TUNEL反應(yīng)液作陰性對(duì)照。

1.5 透射電鏡觀察

將分離的含下頜第一磨牙區(qū)的下頜骨于25 mL/L戊二醛固定液中4℃下初固定2 d，初步修剪標(biāo)本，100 g/L EDTA 脫鈣1 周，0.1 mol/L PBS 液(pH 7.4)沖洗后10 g/L 鋨酸后固定2 h，經(jīng)梯度乙醇(300、500、700、850、950 mL/L無(wú)水乙醇×3次)脫水后，換環(huán)氧乙烷過(guò)渡(環(huán)氧乙烷:包埋劑 =3∶1、1∶1、1 ∶3 及純包埋劑浸透)，逐步過(guò)渡到Spurr包埋劑中包埋，然后升溫聚合、修塊切片，堿性品紅－亞甲藍(lán)染色1～2 min，水沖后，顯微鏡下觀察定位，進(jìn)一步修塊后，80 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色，JEM－1200EX透射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

小鼠出生后第2、5天，成釉細(xì)胞處于分化期，內(nèi)釉上皮分化成為成釉上皮，細(xì)胞器重新定位，細(xì)胞核逐漸遠(yuǎn)基底膜排列，超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)胞漿內(nèi)有高爾基復(fù)合體和線粒體(圖1)，可觀察到成釉細(xì)胞增生的核分裂(圖2);免疫組化結(jié)果顯示Bcl－2陽(yáng)性表達(dá)(圖3)，TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞胞核陽(yáng)性表達(dá)，提示有細(xì)胞凋亡的存在(圖4)。

小鼠出生后第7、9天處于分泌期，成釉細(xì)胞已開(kāi)始分泌，可見(jiàn)新形成的釉質(zhì)，胞核遠(yuǎn)基底排列，胞核附近可見(jiàn)大量線粒體，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量高爾基復(fù)合體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖5)。胞漿呈Bcl－2強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖6);TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有少量成釉細(xì)胞胞核陽(yáng)性表達(dá)(圖7)。

出生后第14天釉質(zhì)發(fā)育完成，成釉細(xì)胞變短，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞器數(shù)量減少，核膜逐漸不清，異染色體增加，核糖體脫顆粒水腫，呈現(xiàn)凋亡征象(圖8)，胞漿則未見(jiàn)Bcl－2陽(yáng)性表達(dá)(圖9)。

圖1 成釉細(xì)胞分化期，胞核大，胞漿可見(jiàn)到高爾基復(fù)合體和線粒體(透射電鏡，×3000)

圖2 成釉細(xì)胞分化期，細(xì)胞可見(jiàn)核分裂征象(透射電鏡，×3000)

圖3 出生后第2天，成釉細(xì)胞分化期，內(nèi)釉上皮細(xì)胞胞核尚未遠(yuǎn)基底排列，細(xì)胞呈Bcl－2陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化，×20)

圖4 出生后第5天，成釉細(xì)胞分化期，胞核開(kāi)始遠(yuǎn)基底排列，TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分成釉細(xì)胞胞核陽(yáng)性表達(dá)(×40)

圖5 出生后第7天，成釉細(xì)胞分泌期，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量線粒體、高爾基復(fù)合體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(透射電鏡，×3000)

圖6 出生后第9天，成釉細(xì)胞分泌期，細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，Bcl－2陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化，×20)

圖7 出生后第7天，成釉細(xì)胞分泌期，釉質(zhì)開(kāi)始形成，胞核遠(yuǎn)基底排列，TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分成釉細(xì)胞胞核呈棕黃色，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)(×40)

圖8 出生后第14天，釉質(zhì)發(fā)育完成，細(xì)胞器數(shù)量減少，核膜逐漸不清，異染色體增加(透射電鏡，×3000)

圖9 出生后第14天，釉質(zhì)發(fā)育完成，細(xì)胞變短，細(xì)胞呈Bcl－2陰性表達(dá)(免疫組化，×20)

3 討論

在胚胎發(fā)育中，組織發(fā)育總是在細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)、增殖和凋亡變化中完成，并處于動(dòng)態(tài)的平衡。細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱編程性細(xì)胞死亡(programmed cell death，POD)，是生命過(guò)程中不可缺少的一種細(xì)胞自我調(diào)節(jié)機(jī)制和多細(xì)胞生物藉以生存的重要細(xì)胞代謝方式，在組織形態(tài)發(fā)生過(guò)程中起到重要的塑型作用，是機(jī)體維持細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)定的重要手段［2］。Bronckers 等［3］研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡可存在于釉質(zhì)發(fā)育的各個(gè)階段，包括成釉細(xì)胞的分化期、分泌期、轉(zhuǎn)變期等。

本研究中觀察到處于分化期、分泌期的成釉細(xì)胞中都呈Bcl－2陽(yáng)性表達(dá)，并在釉質(zhì)分泌的高峰期即小鼠出生后第9天呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。在分化期，內(nèi)釉上皮逐漸分化為成釉上皮，為分泌期做細(xì)胞準(zhǔn)備，超微結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核分裂，此時(shí)細(xì)胞增殖分化活躍，而且TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞胞核陽(yáng)性表達(dá)，提示細(xì)胞凋亡的同時(shí)存在;Bcl－2的陽(yáng)性表達(dá)則表明其參與成釉細(xì)胞分化期的細(xì)胞凋亡調(diào)控。Bcl－2可促進(jìn)細(xì)胞的存活而減少凋亡的發(fā)生，抑制多種基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，平衡細(xì)胞增殖和凋亡。分泌期是釉質(zhì)發(fā)育的最關(guān)鍵階段，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)成釉細(xì)胞內(nèi)有大量參與蛋白合成的高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及提供細(xì)胞能量的線粒體，表明細(xì)胞分泌功能活躍。但TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)分泌期部分細(xì)胞胞核呈陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明此階段也存在細(xì)胞凋亡;而且此階段成釉細(xì)胞對(duì)Bcl－2的陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，提示Bcl－2可以在成釉細(xì)胞數(shù)量不能明顯增加的情況下，增強(qiáng)細(xì)胞存活力，延長(zhǎng)功能細(xì)胞壽命，從而保證足夠的成釉細(xì)胞來(lái)完成分泌功能。而到釉質(zhì)發(fā)育完成后，成釉細(xì)胞明顯變短，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)成釉細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞器減少，細(xì)胞核糖體脫顆粒，部分核膜不清，凋亡征象明顯，與Bcl－2的陰性表達(dá)相一致。此階段成釉細(xì)胞大量減少，最終與中間層、星網(wǎng)狀層以及外釉上皮結(jié)合形成縮余釉上皮。

研究提示:細(xì)胞凋亡是釉質(zhì)發(fā)育形成過(guò)程中的一種有效機(jī)制，以之清除生命周期結(jié)束或功能消失的成釉細(xì)胞，Bcl－2對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，一方面保證足夠的細(xì)胞完成分化后發(fā)揮分泌功能，又限定進(jìn)入下一階段的細(xì)胞數(shù)目，從而維持組織本身細(xì)胞數(shù)目上內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［4］。然而B(niǎo)cl－2對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制目前尚未完全明了，細(xì)胞凋亡失調(diào)(凋亡不足或凋亡過(guò)度)是否可成為某些疾病的重要發(fā)病機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究［5］。

［1］Tsujimoto Y，F(xiàn)inger LR ，Yunis J，et al.Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18)chromosome translocation［J］.Science，1984，226(4678):1097－1099.

［2］Reed JC.Bcl－2－family proteins and hematologic malignancies:history and future prospects［J］.Blood，2008，111(7):3322 －3330.

［3］Bronckers AL ，Goei SW，Dumont E ，et al.In situ detection of apoptosis in dental and periodontal tissues of the adult mouse using annexin－V－biotin［J］.Histochem Cell Biol，2000，113(4):293－301.

［4］Smith CE.Cellular and chemical events during enamel maturation［J］.Crit Rev Oral Biol Med，1998，9(2):128 －161.

［5］Tanner EA，Blute TA，Brachmann CB，et al.Bcl－2 proteins and autophagy regulate mitochondrial dynamics during programmed cell death in the Drosophila ovary［J］.Development，2011，138(2):327－338.