徐 暢, 魏亞紅, 王玉敏, 張 莉, 韓曉謙, 韓婷婷, 高玉光

(山東 濱州 : 1. 濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 256603; 2. 濰坊市坊子區(qū)人民醫(yī)院口腔科 261200)

·基礎(chǔ)研究·

Jun家族蛋白在釉質(zhì)發(fā)育中的表達(dá)及對(duì)amelogenin的調(diào)控作用

徐 暢1, 魏亞紅2, 王玉敏1, 張 莉1, 韓曉謙1, 韓婷婷1, 高玉光1

(山東 濱州 : 1. 濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 256603; 2. 濰坊市坊子區(qū)人民醫(yī)院口腔科 261200)

目的: 探討Jun家族蛋白JunB、c- Jun 和JunD在小鼠釉質(zhì)發(fā)育中的作用。方法: 應(yīng)用免疫組化染色檢測(cè)JunB、c- Jun 和JunD在不同發(fā)育階段小鼠牙胚成釉細(xì)胞中的表達(dá)；分別以0.5 μg和2.0 μg的JunB、c- Jun 和JunD轉(zhuǎn)染小鼠成釉細(xì)胞后，運(yùn)用RT- PCR觀察其對(duì)釉原蛋白amelogenin mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果: 免疫組化染色結(jié)果顯示：釉質(zhì)分泌期時(shí)，JunB在成釉細(xì)胞核中無(wú)顯著表達(dá)，JunD呈弱表達(dá)，而c- Jun表達(dá)明顯; 釉質(zhì)轉(zhuǎn)型期時(shí)，JunB和JunD 表達(dá)增強(qiáng)且JunD 早于JunB, c-Jun持續(xù)表達(dá)明顯; 在釉質(zhì)成熟期時(shí)，JunB、c- Jun和JunD均顯著表達(dá)。RT- PCR檢測(cè)顯示：高劑量JunB可明顯抑制amelogenin的表達(dá)(P<0.05)；低劑量c- Jun可明顯促進(jìn)amelogenin的表達(dá)(P<0.05); JunD對(duì)amelogenin的表達(dá)無(wú)顯著影響。結(jié)論: 在釉質(zhì)發(fā)育早期，c- Jun可通過(guò)上調(diào)釉原蛋白的表達(dá)參與釉質(zhì)發(fā)育。在釉質(zhì)發(fā)育后期，JunB可通過(guò)抑制釉原蛋白的分泌促進(jìn)釉質(zhì)的成熟。JunD對(duì)amelogenin表達(dá)無(wú)顯著影響。

Jun家族蛋白; 釉原蛋白; 免疫組化; RT- PCR

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.09.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(9): 515]

釉質(zhì)的形成是在成釉細(xì)胞合成和分泌的釉質(zhì)基質(zhì)上進(jìn)行的生物礦化過(guò)程。釉原蛋白amelogenin是成釉細(xì)胞分泌的最主要的特異性釉質(zhì)蛋白，占釉質(zhì)發(fā)育階段釉質(zhì)蛋白的90%，其主要作用是調(diào)節(jié)釉質(zhì)晶體的生長(zhǎng)和排列方向。釉原蛋白基因定位于性染色體，人類amelogenin基因突變可導(dǎo)致連鎖性釉質(zhì)發(fā)育不全[1]。Jun家族蛋白成員JunB、c- Jun和JunD是構(gòu)成轉(zhuǎn)錄激活蛋白AP- 1(activator protein- 1)的重要亞基，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤形成等過(guò)程[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，Jun蛋白[3]和釉原蛋白在成釉細(xì)胞中均有表達(dá)。本研究旨在觀察Jun家族成員在釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)，并探討其對(duì)amelogenin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，以期為進(jìn)一步研究Jun家族在釉質(zhì)發(fā)育中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

小鼠成釉細(xì)胞系(ALC，日本秋田大學(xué)Sugiyama教授饋贈(zèng))；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(杭州四季青)；RNAiso Plus、RT- PCR試劑盒 (TaKaRa，日本)；TrannsFastTMTransfection Reagent (Promega，美國(guó))；真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc- HisA-JunB、pcDNA3.1/myc- HisA- c- Jun、pcDNA3.1/myc- HisA-JunD(本實(shí)驗(yàn)室保存)；兔抗鼠JunB、c- Jun和JunD抗體(Santa Cruz，美國(guó))；ABC試劑盒(vector，美國(guó))；DAB試劑盒(北京中杉金橋)。

1.2 免疫組化檢測(cè)成釉細(xì)胞中JunB、c- Jun和JunD的表達(dá)

分別取出生后5、10、15 d小鼠含磨牙牙胚的下頜骨，分別經(jīng)100 mL/L中性甲醛液固定、 100 g/L EDTA溶液低溫脫礦后，常規(guī)石蠟包埋，并制作4 μm連續(xù)切片。取上述組織切片，參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行免疫組化染色：10 mmol/L枸櫞酸鈉溶液(pH 6.0)85～90 ℃處理切片30 min；50 mL/L H2O2/甲醇處理15 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；正常山羊血清室溫封閉20 min；分別滴加JunB(1 ∶200)、c- Jun(1 ∶300)和JunD(1 ∶500)多克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；采用VECTASTAIN? ABC KIT 檢測(cè)后，DAB顯色、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。以 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞深染成顆粒狀棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 RT- PCR檢測(cè)不同劑量JunB、c- Jun和JunD調(diào)控下amelogenin mRNA的表達(dá)水平

小鼠成釉細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，以2×106/mL的密度接種于6孔板，并加入含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)將細(xì)胞隨機(jī)分為3組(每組復(fù)3孔)：1組為2 μg pcDNA3.1/myc-HisA、2組為0.5 μg pcDNA3.1/myc- HisA- JunB/c- Jun/JunD+1.5 μg pcDNA3.1/myc- HisA、3組為2 μg pcDNA3.1/myc- HisA- JunB/c- Jun/JunD；然后按照TransFastTMTransfection Reagent 說(shuō)明書對(duì)各組成釉細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染完成后分別提取各組細(xì)胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s, 59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 采集熒光，40個(gè)循環(huán)后72 ℃ 延伸5 min。Ct值由熒光PCR儀在擴(kuò)增過(guò)程中自動(dòng)讀出，對(duì)各組所得Ct值進(jìn)行2-△△CT分析，并計(jì)算出各組amelogenin基因的mRNA表達(dá)水平。所用PCR引物見表1。

表1 PCR引物及其擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 JunB在成釉細(xì)胞中的表達(dá)及不同劑量JunB對(duì)amelogenin mRNA表達(dá)的調(diào)控

不同發(fā)育階段小鼠的磨牙牙胚經(jīng)JunB抗體免疫組化染色顯示，JunB釉質(zhì)分泌期的成釉細(xì)胞核中無(wú)顯著表達(dá)(圖1a)，隨著釉質(zhì)發(fā)育的成熟其表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖1b)，釉質(zhì)成熟期呈顯著表達(dá)(圖1c)。Real- Time PCR結(jié)果顯示，成釉細(xì)胞中轉(zhuǎn)染0.5 μg的 pcDNA3.1/myc- HisA- JunB時(shí)，對(duì)amelogenin基因的表達(dá)未見顯著影響，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；當(dāng)JunB的轉(zhuǎn)染增加至2 μg時(shí)，成釉細(xì)胞中的amelogenin mRNA表達(dá)水平明顯下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明高劑量JunB可抑制成釉細(xì)胞中amelogenin mRNA的表達(dá)(圖2)。

a.在釉質(zhì)分泌期無(wú)顯著表達(dá)b.轉(zhuǎn)型期表達(dá)增強(qiáng) c.成熟期顯著表達(dá)

s-am:分泌期成釉細(xì)胞; t-am:轉(zhuǎn)型期成釉細(xì)胞; m-am:成熟期成釉細(xì)胞; od:成牙本質(zhì)細(xì)胞; e:釉質(zhì); es：釉質(zhì)間隙

圖1 JunB在小鼠磨牙牙胚成釉細(xì)胞中的表達(dá)(IHC,×100)

圖2 JunB對(duì)amelogenin mRNA表達(dá)水平的影響

2.2 c- Jun在成釉細(xì)胞中的表達(dá)及不同劑量c- Jun對(duì)amelogenin mRNA表達(dá)的調(diào)控

免疫組化染色顯示，c- Jun在小鼠釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)較早，其在釉質(zhì)分泌期的成釉細(xì)胞核中即明顯表達(dá)(圖3a)，并持續(xù)到轉(zhuǎn)型期(圖3b)和釉質(zhì)成熟期(圖3c)。RT- PCR結(jié)果顯示，當(dāng)成釉細(xì)胞核中轉(zhuǎn)染低劑量(0.5 μg)的c- Jun時(shí)，可明顯促進(jìn)amelogenin mRNA的表達(dá)(P<0.05)；而當(dāng)c- Jun的轉(zhuǎn)染劑量增加至2 μg時(shí)，對(duì)amebgenin mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用不明顯，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05) (圖4)。

a.分泌期有明顯表達(dá) b.轉(zhuǎn)型期顯著表達(dá) c.成熟期顯著表達(dá)

s-am:分泌期成釉細(xì)胞；t-am:轉(zhuǎn)型期成釉細(xì)胞；m-am:成熟期成釉細(xì)胞；od:成牙本質(zhì)細(xì)胞；e:釉質(zhì)；es：釉質(zhì)間隙

圖3 c-Jun 在小鼠磨牙牙胚成釉細(xì)胞中的表達(dá)(IHC,×100)

圖4 c-Jun對(duì)amelogenin mRNA 表達(dá)水平的影響

2.3 JunD在成釉細(xì)胞中的表達(dá)及不同劑量JunD對(duì)amelogenin mRNA表達(dá)的調(diào)控

免疫組化染色顯示，JunD在分泌期成釉細(xì)胞核中呈弱陽(yáng)性表達(dá) (圖5a)，到轉(zhuǎn)型期時(shí)JunD的表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖5b)，而在釉質(zhì)發(fā)育成熟期則持續(xù)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖5c)。RT- PCR結(jié)果顯示，成釉細(xì)胞中轉(zhuǎn)染0.5、2 μg不同劑量的JunD時(shí)，對(duì)成釉細(xì)胞中amelogenin mRNA表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)(圖6)。

a.在釉質(zhì)分泌期呈弱表達(dá)b.轉(zhuǎn)型期表達(dá)增強(qiáng) c.成熟期顯著表達(dá)

s-am:分泌期成釉細(xì)胞；t-am:轉(zhuǎn)型期成釉細(xì)胞；m-am:成熟期成釉細(xì)胞；od:成牙本質(zhì)細(xì)胞；e:釉質(zhì)；es：釉質(zhì)間隙

圖5 JunD在小鼠磨牙牙胚成釉細(xì)胞中的表達(dá)(IHC,×100)

圖6 JunD對(duì)amelogenin mRAN表達(dá)水平的影響

3 討論

釉質(zhì)發(fā)育分為分泌期、轉(zhuǎn)型期和成熟期3個(gè)連續(xù)過(guò)程[5]。本實(shí)驗(yàn)中JunB在成釉細(xì)胞中的表達(dá)特征提示，JunB的主要作用是通過(guò)抑制釉質(zhì)蛋白的分泌而促進(jìn)釉質(zhì)發(fā)育的成熟；免疫組化結(jié)果表明c-Jun在釉質(zhì)分泌期顯著表達(dá)，而RT-PCR檢測(cè)提示低劑量c-Jun促進(jìn)釉質(zhì)基質(zhì)蛋白amelogenin的表達(dá)。這一研究結(jié)果提示c-Jun在釉質(zhì)分泌期通過(guò)上調(diào)釉質(zhì)蛋白的分泌而促進(jìn)釉質(zhì)發(fā)育。JunD在成釉細(xì)胞中的表達(dá)特征(在釉質(zhì)發(fā)育不同階段均有表達(dá)，且隨釉質(zhì)發(fā)育成熟表達(dá)逐漸增強(qiáng))提示，JunD參與了釉質(zhì)發(fā)育的過(guò)程，但RT- PCR結(jié)果顯示JunD對(duì)amelogenin的表達(dá)無(wú)顯著影響，說(shuō)明JunD在釉質(zhì)發(fā)育中的作用與釉質(zhì)蛋白的表達(dá)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。Jun家族蛋白成員JunB、c- Jun和JunD之間可通過(guò)形成同源二聚體或與Fos蛋白形成異源二聚體構(gòu)成AP- 1，然后與DNA的特異性序列相結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等[6]。有研究表明，AP- 1可通過(guò)作用于Mmp20啟動(dòng)子的AP- 1結(jié)合位點(diǎn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7]。amelogenin作為釉質(zhì)基質(zhì)蛋白的主要成分，在釉質(zhì)分泌期表達(dá)逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)型期表達(dá)顯著下降[8]。有研究顯示，人類amelogenin基因突變可導(dǎo)致連鎖性釉質(zhì)發(fā)育不全[1]。鑒于amelogenin基因的啟動(dòng)子區(qū)含有AP- 1位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT- PCR觀察了不同劑量JunB、c- Jun和JunD對(duì)amelogenin基因表達(dá)的調(diào)控作用。RT- PCR結(jié)果顯示，JunB、 c- Jun以及JunD在釉質(zhì)發(fā)育中的作用顯著不同；免疫組化染色結(jié)果顯示， JunB、 c- Jun以及JunD在釉質(zhì)發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)亦不同。因此我們認(rèn)為，JunB、c- Jun和JunD在釉質(zhì)發(fā)育各個(gè)階段的作用不同，可能是3者通過(guò)不同的分子作用機(jī)制參與了釉質(zhì)的發(fā)育過(guò)程。

總之，Jun家族蛋白成員具有不同的時(shí)空表達(dá)順序，提示3者在釉質(zhì)形成中發(fā)揮著不同的作用，共同參與了釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程。但由于蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、調(diào)控機(jī)制的多樣性，這些基因是如何受控開放和關(guān)閉的，尚有待進(jìn)一步探索。

[1]Oliveira FV, Gurgel CV, Kobayashi TY,etal. Amelogenesis imperfecta and screening of mutation in amelogenin gene [J].CaseRepDent, 2014，2014:319680.

[2]Jochum W, Passegue E,Wagner EF. AP- 1 in mouse development and tumorigenesis [J].Oncogene, 2001, 20(19): 2401-2412.

[3]Nishikawa S. Localization of transcription factor AP- 1 family proteins in ameloblast nuclei of the rat incisor [J].JHistochemCytochem, 2000, 48(11): 1511-1520.

[4]Gao Y, Ganss BW, Wang H,etal. The RING finger protein RNF11 is expressed in bone cells during osteogenesis and is regulated by Ets1 [J].ExpCellRes, 2005, 304(1): 127-135.[5]Bartlett JD. Dental enamel development: proteinases and their enamel matrix substrates [J].ISRNDent, 2013，16;2013:684607.

[6]Hess J, Angel P,Schorpp- Kistner M. AP- 1 subunits: quarrel and harmony among siblings [J].JCellSci, 2004, 117(25): 5965-5973.

[7]曲政, 王玉敏, 李博涵, 等. EGF/EGFR/ErbB2調(diào)控成釉細(xì)胞MMP- 20基因表達(dá)的研究 [J]. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志, 2013, 23(7): 417-423.

[8]魏亞紅, 孫巖, 張娟娟, 等. 釉成熟蛋白和釉原蛋白基因在小鼠牙胚發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)研究 [J]. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志, 2009, 19(9): 497-502.

The expression of Jun family proteins in enamel development and the effect on amelogenin

XU Chang*, Wei Ya- hong, WANG Yu- min, ZHANG Li, HAN Xiao- qian, HAN Ting- ting, GAO Yu- guang

(*SchoolofStomatology,BinzhouMedicalUniversity,Binzhou256603,China)

AIM: To investigate the role of Jun family proteins in enamel development of mouse. METHODS: Immunohistochemical staining was applied to detect the expression of JunB, c- Jun and JunD in mouse tooth germ ameloblasts. RT- PCR was employed to evaluate the effect on the mRNA expression of amelogenin after transfection of the ameloblasts by JunB, C-Jun and JunD at 0.5 μg and 2.0 μg respectively. RESULTS: At the secretion stage, JunB was not expressed and JunD was weakly expressed in ameloblasts nuclei, but c- Jun was obviously expressed. At the transition stage, JunB and JunD expression were increased and JunD was earlier than JunB. c- Jun continuously exhibited strong expression. At the maturation stage, all of the proteins were strongly expressed. Transfection results showed that high dose of JunB inhibited the expression of amelogenin. Low dose of c-Jun evidently enhanced the expression of amelogenin JunD had no significant effect on amelogenin expression. CONCLUTION: c- Jun may up- regulate the expression of amelogenin at the early stage of enamel development. JunB may suppress the secretion of amelogenin and promote the maturation of enamel at the late stage of enamel development. JunD has no significant effect on amelogenin.

Jun family proteins; amelogenin; immunohistochemistry ; RT- PCR

2015-01-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170927)

徐 暢(1992-), 女，漢族，山東東營(yíng)人。本科生(導(dǎo)師：高玉光)

高玉光, E-mail : gaoyuguang@yahoo.com

R780.2

A

1005-2593(2015)09-0515-05