常 悅, 張小平, 王明潔, 王 月, 崔淑霞

(河南 鄭州 450052: 1.鄭州大學第四附屬醫(yī)院口腔科;2. 河南省中醫(yī)院口腔科; 3. 河南省口腔醫(yī)院正畸科)

不同正畸力對大鼠牙周組織改建的相關研究

常 悅1, 張小平2, 王明潔1, 王 月1, 崔淑霞3

(河南 鄭州 450052: 1.鄭州大學第四附屬醫(yī)院口腔科;2. 河南省中醫(yī)院口腔科; 3. 河南省口腔醫(yī)院正畸科)

目的: 觀察不同正畸力作用不同時間后，大鼠移動牙張力側牙周組織中的BMP- 2表達變化及牙周組織的改建。方法: 將健康雄性Wistar大鼠60只，隨機分成4組(n=15)，分別施加0 g(A組)、30 g(B組)、50 g(C組)、80 g(D組)力，建立左上第一磨牙移動模型。分別于加力后1、3、7、14、21 d，測量各組牙齒移動的距離；取實驗牙——牙周組織聯(lián)合切片，HE染色法觀察牙周組織變化,免疫組化法檢測張力側牙周組織中BMP- 2的表達。結果: 牙齒移動以C組最大，B組次之，D組最??；HE染色顯示，A組牙周組織無明顯變化，B組和C組牙周組織改建活躍，張力側可見新生的成骨細胞，D組牙周膜纖維排列混亂,并可見牙根局限性的吸收；免疫組化染色顯示，BMP- 2主要分布于牙周韌帶中，尤其是近牙槽骨和牙骨質的區(qū)域染色較強，各加力組BMP- 2表達水平均明顯升高，并隨著力值的增大而增加(P﹤0.05)，C組與D組相比，各時間點均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結論: BMP- 2的表達與力值大小呈正相關，50 g的正畸力值促進牙周組織改建最明顯。

正畸力; 大鼠; 牙槽骨改建; BMP- 2

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.09.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(9):529]

生理狀態(tài)下牙周組織處于成骨和破骨的動態(tài)平衡之中，而在正畸力作用下牙周組織則會發(fā)生適應性改建，表現(xiàn)為壓力側破骨細胞增生活躍，以骨吸收為主；張力側成骨細胞增生活躍，以骨生成為主。但在正畸治療過程中以多大的正畸力才能安全有效的加速牙齒移動，一直是廣大學者關注的課題。BMPS是轉化生長因子-β(TGF- β)超家族成員，主要參與機體的成骨活動；其中BMP- 2是其家族中研究最廣泛，誘導活性最強且唯一能單獨誘導成骨的因子[1-2]。本實驗通過建立大鼠牙齒移動模型，觀察不同正畸力作用下，張力側牙周組織中BMP- 2表達的變化，以期更深入了解成骨細胞活化的時機和機制，并為進一步探討不同力值與牙周組織改建的關系奠定生物學基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、材料和儀器

Wistar大鼠(河南省動物實驗中心提供)；游標卡尺(桂林廣陸數(shù)字測控股份)；彈簧測力計(杭州西湖生物材料)；鎳鈦螺旋拉簧(北京圣馬特科技)；正畸用0．020 mm結扎絲(杭州森風齒科材料廠)；BMP抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術開發(fā))。

1.2 大鼠正畸牙移動模型的建立

1.2.1 實驗動物分組

取10周齡雄性Wistar大鼠60只(體質量210～227 g)，要求牙體、牙列完整，無齲齒及牙周組織疾?。黄胀暳线m應性飼養(yǎng)(分籠)1周后，按不同正畸力值將其隨機分為4組：0 g(A組)、30 g(B組)、50 g(C組)、80 g(D組)(n=15)。

1.2.2 不同正畸力值牙移動裝置的安裝

所有大鼠經(jīng)100 mL/L水合氯醛腹腔注射麻醉并固定后，首先用牙科高速渦輪機和尖頭金剛砂車針分別在各大鼠上頜的中切牙和左側第一磨牙頸部、頰側面及近中軸面各制備一淺凹；然后分別將0.020 mm正畸結扎絲從各大鼠的左上第一、第二磨牙的鄰間隙穿過，并連接于預備好的NiTi拉簧一端備用。用正畸測力計將各組的正畸力分別調整至0、30、50、80 g后，用游標卡尺分別測量各力值所拉伸的距離；然后，另取一段結扎絲，分別與各大鼠拉簧的另一端連接，將其拉伸至相應組所設力值的長度，并固定于中切牙的固位溝內(nèi)，使之以上頜兩個中切牙為支抗向前移動第一磨牙；最后用樹脂粘結劑覆蓋結扎絲和固位溝以加強固位(圖1)。牙移動裝置安裝后，每日檢查動物口腔并測量力值以保證力值恒定，發(fā)現(xiàn)螺旋拉簧脫落則重新加載。為補償螺簧應力疲勞及牙移動引起的力值衰減，每周加力1次。

圖1 牙移動裝置安裝情況

1.3 牙移動距離的測量

分別于牙齒移動裝置安裝后1、3、7、14、21 d各時間點，每組各隨機抽取3只大鼠，分別用40 mL/L 多聚甲醛液心內(nèi)灌注處死后，分離各大鼠的左側上頜骨，并用游標卡尺測量其上頜左側第一磨牙遠中舌溝點與第二磨牙近中舌溝點間的距離。所有測量均由同一人完成，測量精確0.01 mm，每個樣本測量3次取均值。

1.4 移動牙牙周組織切片的制備

上述測量結束后，立即截取含上頜第一、第二磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊，并將其置于40 mL/L 中性多聚甲醛液中固定48 h。將固定后的各組織塊置于100 g/L EDTA(pH 7.4)中， 4 ℃條件下脫鈣至大頭針能順利扎入牙中(4～6周)后，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋；然后平行于牙體長軸，制備牙——頜骨近遠中向縱切片(片厚5 μm)。

1.5 常規(guī)組織學觀察

取各大鼠的牙周組織切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察其牙周組織的變化情況，并拍照。

1.6 免疫組化染色觀察各組牙周組織中BMP- 2的表達水平

取各組切片脫蠟至水化，30 mL/L過氧化氫液封閉10 min后, 1 g/L胰蛋白酶室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗2 min×3次，滴加50 μL一抗(BMP- 2抗體的1 ∶50稀釋液)4 ℃過夜；PBS緩沖液(pH 7.2～7.6)洗滌10 min×3次，37 ℃ 復溫1 h；滴加50 μL DAKO二抗復合物，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色；蒸餾水沖洗，蘇木素輕度復染；蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡觀察并拍照。

然后利用Biosens Digital Imaging Systen(上海山富科學儀器有限公司)高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng),對每張免疫組化染色后的組織切片進行BMP- 2定量分析：以第一磨牙張力側(遠中)根中1/3處的近牙骨質側的牙周膜為測量部位，分別從每張切片的測量部位各隨機選擇3個視野，計算機計算各標本該部位的平均積分光密度值(IOD)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同力值組大鼠的牙移動距離比較

牙移動距離測量結果顯示，各組牙移動周期均符合3個階段：①瞬時運動階段(1～7 d); ②遲滯期(7～14 d); ③加速移動階段(14～21 d)。各組各時間點的牙移動距離均以C組最大(1 d時除外); B組次之，D組最?。籅組與C組相比在7、14、21 d時差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B組與D組相比在1、3、7、14 d時差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05); C組與D組相比在1、3、7、14、21 d差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 不同力值組大鼠牙移動距離比較

2.2 HE染色觀察結果

A組各時間點的牙周膜近遠中間隙均等寬，且膠原纖維排列規(guī)則，破骨細胞少見(圖2a)。B組壓力側牙周膜變窄，牙槽骨邊緣可見少量的骨吸收陷窩和破骨細胞(圖2b)。C組牙周組織反應活躍,牙周膠原纖維排列不規(guī)則，牙槽骨邊緣可見大量的骨吸收陷窩和破骨細胞；張力側牙周膜間隙增寬，血管擴張，新生的成骨細胞沿牙槽骨側排列(圖2c)。D組壓力側牙周膜纖維排列混亂，有明顯的牙槽骨和牙骨質的吸收，破骨細胞少見；張力側牙周纖維斷裂，新生的成骨細胞和成牙骨質細胞少見(圖2d)。

2.3 各組牙周組織中BMP- 2的定性、定量分析

正常對照組(A組)牙周組織中的BMP- 2主要分布于牙周膜及其周圍組織細胞的胞質中，尤其是鄰近牙槽骨和牙骨質的區(qū)域陽性染色較強，成骨細胞和成纖維細胞染色均為陽性(圖3a)；其張力側牙周組織中的BMP-2在各時間點的表達均無明顯變化(表2)。B組隨著加力時間的延長張力側BMP- 2陽性細胞數(shù)目逐漸增多，且染色加深，7 d時達到高峰(圖3b)，14 d開始逐漸下降，21 d接近正常組水平；其平均IOD與A組相比，在3、7、14、21 d各時間均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表2)。C組張力側BMP- 2陽性細胞數(shù)目明顯增多(圖3c)，其平均IOD與A組相比，在各時間點均有統(tǒng)計學差異(P﹤0.05)，而與B組相比，在1、3、7、14 d各時間點均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；21 d時其平均IOD仍處于較高水平，與B組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。D組張力側BMP- 2染色加深(圖3d)，其平均IOD與A組相比，各時間點均有統(tǒng)計學差異(P﹤0.05)；與B組相比，在1、7、14、21 d各時間點均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而與C組相比，各時間點均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同力值組張力側牙周膜中 BMP- 2的IOD值比較

不同字母組間P﹤0.05

圖2 各組牙周組織HE染色觀察(10×40)

圖3 各組張力側牙周組織中BMP- 2的表達和分布(10×40)

3 討論

正畸力適當與否是正畸牙齒移動的關鍵因素，King等[3]分別以20、40、60 g的正畸力對大鼠的牙齒進行移動時發(fā)現(xiàn)， 40～60 g是正畸牙齒移動的適當力值范圍，可以觀察到特征性的牙齒移動及相關骨改建的過程。燕濱漪等[4]報道，對大鼠的磨牙施加80～100 g的力時，其壓力側出現(xiàn)了廣泛的透明樣變，并伴有潛行性骨吸收，且牙移動緩慢。因此本實驗分別選用小力值(30 g)、中力值(50 g)、大力值(80 g)來研究大鼠牙周組織的變化情況。

在正畸過程中，牙齒移動會伴隨著牙槽骨的改建，因此動物實驗常以牙移動速度來動態(tài)的反映骨改建的情況。本實驗中牙齒移動距離顯示，各組 1～7 d 時的牙齒移動距離有明顯差異，即B組(30 g)和C組(50 g)的牙齒移動快，說明其牙周組織改建活躍，從而導致了牙槽骨表面直接骨吸收，使其牙齒移動距離較大; 7～14 d時各組牙齒移動速度較慢。組織學觀察顯示：壓力側血管壓縮、血流受阻，在牙周膜內(nèi)出現(xiàn)玻璃樣變結構，牙槽骨改建停滯(圖2b)；其中D組(80 g)的牙齒移動距離最小，壓力側牙周組織中破骨細胞較少，壓力側根中部可見牙骨質的吸收, 牙槽骨表面出現(xiàn)不規(guī)則的破骨陷窩，且以潛掘性吸收為主(圖2d)。這可能是由于力值過大，牙槽骨改建受到抑制的緣故。14～21 d時，B組和C組的牙齒移動距離增大，說明其進入了進行性牙齒移動階段，其中C組移動距離最大，說明其牙周組織改建活躍，并提示該力值(50 g)是牙槽骨改建的最適力值；而D組的牙齒移動基本停滯，可能因為其牙周受損仍然嚴重，只有待變性的牙周組織完全清除后，牙齒才能移動，所以牙齒移動緩慢。

BMP- 2是較強的成骨細胞因子,參與BMP-Smad信號傳導通路[5]，在體內(nèi)可通過自分泌和旁分泌的方式促進骨、軟骨等相關結締組織的形成[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP- 2在張力側牙周韌帶(PDL)中，尤其在PDL新生的牙骨質和牙槽骨附近染色較強，在牙槽骨外側骨板和牙槽嵴附近也有BMP- 2的表達，并與PDL中BMP- 2區(qū)相連系；提示，BMP- 2與牙槽骨的改建有很大的聯(lián)系[8-9]。本結果顯示：A組張力側牙周組織中BMP- 2染色較淺，可能與未加力狀態(tài)下，牙周組織自分泌形式維持其穩(wěn)態(tài)有關；B組BMP- 2 IOD在各加力組中相對較低，說明其對張力側牙周膜及牙槽骨中的成骨細胞和成纖維細胞的激活能力低，從而使牙槽骨改建不活躍；C組BMP- 2 IOD較B組有所增高特別在加力1 d和21 d時，與B組相比差異具有統(tǒng)計學意義，說明C組牙周組織改建活躍，該力值能促進張力側成骨細胞和成纖維細胞的增殖和分化；D組BMP- 2 IOD與對照組相比差異顯著并呈增加趨勢，但與C組相比各時間點的差異均無統(tǒng)計學意義，可能是D組牙周組織破壞嚴重，牙槽骨改建延遲的緣故。本實驗中BMP- 2表達水平的最高峰出現(xiàn)在加力的第7 d，而陳遠萍等[10]報道，BMP- 2表達的最高峰出現(xiàn)在加力的第5 d, 其原因可能是由于本實驗以整個正畸療程為1個周期，未將5 d納入到此周期范圍，因而高峰出現(xiàn)在第7天，但BMP- 2的變化趨勢與其研究的結果相一致。

Frost的機械閾值理論認為，如果應變量很小，骨代謝則處于負平衡狀態(tài)，以骨吸收為主，從而導致骨量丟失；如應變量增加，骨代謝則進入正平衡狀態(tài)，骨沉積增加；如應變量繼續(xù)增大且超過一定界限，則骨代謝又表現(xiàn)為負平衡，骨組織中會出現(xiàn)微小損傷，并且修復的速度不能趕上損傷的速度，從而導致骨量減少。本結果與上述理論相一致，即：30 g力時應變量很小，骨代謝處于負平衡狀態(tài)，以骨吸收為主，表現(xiàn)為成骨活動不活躍，牙槽骨改建緩慢；50 g力時，應變量增加，骨代謝進入正的平衡狀態(tài)，以骨沉積為主，表現(xiàn)為成骨活動活躍，牙槽骨改建較快; 80 g力時, 超過牙周膜改建的最適力值，牙周組織破壞嚴重，從而使骨代謝進入負平衡狀態(tài)，表現(xiàn)為成骨和破骨活動均不活躍，牙槽骨改建停滯，骨量減少。本實驗通過觀察不同力值作用不同時間后，BMP- 2 在移動牙張力側牙周組織中的表達情況，了解了不同力值對于大鼠牙周組織改建的影響。結果提示，在正畸過程中關閉拔牙間隙時，并不是力值越大越好，力值過大反而抑制了牙齒的移動，其中以50 g的力值最佳,既利于牙槽骨改建又可提高牙齒移動的效能。但這只是初步階段，如何利用BMP- 2促進成骨的特性，將其用于正畸臨床中以加速牙齒移動，并改善牙周病患者正畸治療的風險，還有待更深入的研究。

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The related study of the effect of different orthodontic force on the rebuilding of periodontal tissue in rats

CHANG Yue*, ZHANG Xiao- ping, WANG Ming- jie, Wang Yue, CUI Shu- xia

(*DepartmemtofOrthodontics,theForthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

AIM: To investigate the effect of different orthodontic force on BMP- 2 expression in the tension side of periodontal tissues of rat during orthodontic tooth movement. METHODS：60 healthy rats were randomly divided into 4 groups (n=15) and were subjected to different orthodontic forces：group A (0 g), group B (30 g), group C (50 g) and group D (80 g). The distance of orthodontic tooth movement was determined after adding the forces for 1, 3, 7, 14 and 21 d, respectively. Then the rats were executed and the periodontal tissue of the maxiallary first molars were observed by HE staining. The expression of BMP- 2 in periodontal tissue in the tension side was determined by immunohistochemical method. RESULTS: The distances of orthodontic tooth movement were as in following order: group C>B>D>A. HE staining r showed that there were no significant changes in the periodontal tissue in group A. The periodontal tissue rebuilt in groups B and C was active and osteoblasts were more in the tension side of the periodontal tissue. While in group D, periodontal ligament fibers were in disorder and root resorption was observed . Immunohistochemical staining showed that BMP- 2 was mainly distributed in periodontal ligament, especially in alveolar bone and cementum region, With the increase of orthodontic force, the expression of BMP- 2 increased (P﹤0.05). No statistically significant difference was observed between group C and group D. CONCLUSION: The expression of BMP- 2 is highly related with the orthodontic force strength. 50 g orthodontic force can promote periodontal tissue remodeling.

orthodontic force; rat; alveolar bone remodeling; BMP- 2

2015-01-11

省教育廳重點項目(13A320625)

常 悅(1987-),女，漢族，河南鄭州人。碩士

崔淑霞，E-mai:cui-shuxia@163.com

R783.5

A

1005-2593(2015)09-0529-05