房 明，汪 濤，王 欣，王新文，王勤濤

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032)

牙周炎和糖尿病(Diabetes mellitus，DM)都是人類最常見的慢性疾病。許多研究證明牙周病與糖尿病之間有相互聯(lián)系，并且已經(jīng)將牙周病列為糖尿病的第六大并發(fā)癥［1－2］。糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)是體內(nèi)持續(xù)高血糖刺激下形成的非酶氧化的不可逆蛋白之一，與糖尿病的多種并發(fā)癥均有密切關(guān)系［3］，當(dāng)AGEs與人牙周膜成纖維細(xì)胞表面的特異性受體(Receptor of advanced glyation end products，RAGE)結(jié)合后可刺激細(xì)胞分泌炎癥因子，加速細(xì)胞的凋亡過程等，繼而對牙周組織的損傷和修復(fù)造成影響。NF－κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與諸多免疫調(diào)節(jié)作用，例如細(xì)胞凋亡、腫瘤壞死等［4］。有研究指出［5］，AGEs能抑制人牙齦成纖維細(xì)胞的增殖，并可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶－1的合成，導(dǎo)致膠原降解，加劇糖尿病病人牙周炎的進(jìn)程。

本研究通過觀察糖基化終產(chǎn)物對人牙周膜細(xì)胞增殖及NF－κB表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討糖尿病伴慢性牙周炎的發(fā)病機制，并為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基(HyClone，美國);胰蛋白酶、胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司);I型膠原酶(Gibco，美國);人血清白蛋白(Sigma，美國);流式細(xì)胞分析儀(Beckman Coulter，美國);Power/PAC 300 電泳儀(Bio－RAD，美國);7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems，美國);細(xì)胞總RNA提取試劑盒 TRIZOL Reagent(Invitrogen，美國);SYBY Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)、TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit(寶生物工程有限公司);SW－CJ－2D型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司);XDS－1B型倒置相差顯微鏡(重慶光電設(shè)備廠);CO2孵箱(Shellab，美國)。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)

選取18～21歲志愿者因正畸減數(shù)而拔除的前磨牙，用含慶大霉素的PBS浸泡3～5 min后，普通PBS漂洗3遍，在無菌條件下銳性刮取牙根中部1/3的牙周膜組織，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊后平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入3 mg/mL I型膠原酶消化45 min(37℃，50 mL/L CO2)，輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行離心(800 r/min，5 min)，棄上清液。將細(xì)胞沉淀含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，再次離心(800 r/min，5 min)，棄上清液，將細(xì)胞沉淀平鋪于6孔板內(nèi)，以無菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入1.5 mL含100 mL/L胎牛血清、200 U/mL慶大霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37℃，50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每3 d換液1次，待細(xì)胞生長匯合達(dá)80%時進(jìn)行傳代。

1.2.2 AGEs體外制備

根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法，分別取 0.5 g人血清白蛋白、3.0 g D －葡萄糖、1000 μg青霉素和500 μg慶大霉素加于10 mL濃度為0.5 mol/L的PBS(pH=7.4)中，避光 37 ℃孵育120 d。用 PBS(pH=7.4)充分透析以除去未結(jié)合的葡萄糖后，經(jīng)熒光分光光度計掃描鑒定，其AGEs質(zhì)量濃度為26.61 mg/mL。

1.2.3 AGEs對hPDLFs NF－κB mRNA 表達(dá)的影響

1.2.3.1 實驗分組及處理

取生長狀態(tài)良好的第5代牙周膜細(xì)胞，以3×105/mL密度接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶，置 37℃，50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合達(dá)80%時，棄原液，并隨機分為陰性對照組(L組)、高糖組(H組)和 AGEs組(A組)。L組加入含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基;H組加入含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基;A組加入含5.5 mmol/L葡萄糖，AGEs 終末濃度為 100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3.2 Real Time PCR 檢測 NF－κB mRNA 表達(dá)

分別于培養(yǎng)后12、24、36 h取各組細(xì)胞，采用TRIZOL Reagent一步法提取總RNA，紫外分光光度計定量后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，同時參照GenBank數(shù)據(jù)庫，采用Primer primer 5.0計算機軟件設(shè)計引物，并由Takara公司合成，基因序列見表1。反應(yīng)條件參考產(chǎn)品說明，進(jìn)行熒光實時定量PCR檢測，用ABI 7500 real time system SDS軟件分析結(jié)果。

表1 引物設(shè)計基因序列

1.2.4 AGEs對 hPDLFs增殖能力的影響

同1.2.3.1 分組處理后繼續(xù)培養(yǎng) 36 h 后，胰酶消化后棄上清，加入2 mL 7000 mL/L無水乙醇和1 mL PBS吹打混勻后，于4℃固定細(xì)胞24 h，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞各周期的DNA含量，計算各組細(xì)胞在G1、S、G2期的比例，以%S+%G2反映細(xì)胞的增殖能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AGEs對 hPDLFs NF－κB mRNA 表達(dá)的影響

各組各時間點NF－κB mRNA表達(dá)量均以陰性對照組(L組)最低，AGEs(A組)組最高，各組間兩兩相比，在12、24、36 h時H組、A組均明顯高于L組(P＜0.05);A組與H組相比，12 h時無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，24 h和36 h時差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);各組組內(nèi)各時間點 NF－κB mRNA表達(dá)量相比L組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);H組36 h時明顯高于12 h和24 h(P＜0.05);A組各時間點之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，即NF－κB mRNA表達(dá)隨AGEs作用時間延長而增加，具有時間依賴性(表2)。

表2 各組不同時間點NF－κB mRNA的表達(dá)()

表2 各組不同時間點NF－κB mRNA的表達(dá)()

不同字母同組不同時間點相比，P＜0.05;★同一時間點內(nèi)與陰性對照組相比P＜0.05;▲同一時間點內(nèi)與H組相比P＜0.05

時間(h)L H A 12 0.996 ±0.009 1.104 ±0.059a★ 1.122 ±0.002a★24 0.977 ±0.058 1.086 ±0.051a★ 1.356 ±0.003b★▲36 0.946 ±0.160 1.811 ±0.006b★ 2.352 ±0.125c★▲

2.2 AGEs對hPDLFs增殖能力的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如(圖1)，經(jīng)計算各組%S+%G2以A組最低，與H組、L組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，H組與L組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)(表3)。

圖1 各組流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

表3 3組細(xì)胞增殖能力的比較()

表3 3組細(xì)胞增殖能力的比較()

不同字母組間P＜0.05

分組%S+%G2 L 組 23.74 ±0.51a H 組 23.71 ±0.56a A 組 19.57 ±0.74b

3 討論

糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是一種非酶糖基化的大分子蛋白質(zhì)，一旦形成便不可逆，在正常人體內(nèi)可隨年齡的增長而緩慢增加，但是在長期高血糖的刺激下會導(dǎo)致其形成加速，大量積聚［7］。關(guān)于AGEs對糖尿病病人持續(xù)高血糖狀態(tài)下的牙周組織特別是牙周膜細(xì)胞的影響機制和方式，目前尚無定論。Murillo等［8］發(fā)現(xiàn)，AGEs可降低人牙齦成纖維細(xì)胞(hGF)和人牙周膜成纖維細(xì)胞(hPDLF)的遷移率和附著率。Hyun Sook Kim等［9］發(fā)現(xiàn)單純高糖培養(yǎng)環(huán)境對人牙周膜細(xì)胞增殖有一定的抑制作用。

NF－κB是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生理病理過程中發(fā)揮作用。近年的研究表明，NF－κB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切，其參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，具有抑制細(xì)胞凋亡及促細(xì)胞凋亡的雙向作用［10］。AGEs與其受體RAGE結(jié)合后促使NF－κB活化，延長壓制內(nèi)源性自動調(diào)整的反饋抑制循環(huán)的時間［11］。Maczurek等［12］研究發(fā)現(xiàn)，AGEs與RAGE相互作用后，可通過激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)氧化應(yīng)激并激，活核因子NF－κB而上調(diào)多種細(xì)胞因子的生成(如 TNF－α，IL－1β，IFN－γ)，參與組織損傷。

本研究通過Real Time PCR技術(shù)檢測AGEs刺激不同時間下hPDLFs表達(dá)NF－κB的影響，并使用流式細(xì)胞儀檢測了相應(yīng)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示:AGEs對牙周膜細(xì)胞NF－κB mRNA的表達(dá)有明顯加強作用，并且對牙周膜細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用。這一結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。雖然高糖組對牙周膜細(xì)胞的凋亡和增殖有一定的影響，但其作用不如AGEs明顯，提示在糖尿病病人的牙周病變中，AGEs對牙周組織的破壞可能起到了更重要的作用。汪濤等［13］發(fā)現(xiàn)牙周基礎(chǔ)治療后患有糖尿病伴慢性牙周炎病人的PD、AL、空腹血糖水平均有明顯改善，但是對AGEs水平控制并不理想。因此，在臨床治療糖尿病伴慢性牙周炎的過程中，積極控制病人血糖的同時，如能有效地阻斷AGEs與其受體RAGE的聯(lián)合效應(yīng)，可能會達(dá)到更佳的治療糖尿病伴慢性牙周炎的效果。

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