趙 娜，王玉民，孫學(xué)玲，曲 正，孫 巖，張娟娟，高玉光

(山東:1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，濰坊 261053;2.山東大學(xué)附屬齊魯醫(yī)院口腔科，濟(jì)南 250012;3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，濱州 256603)

AP－2(Activating protein－2，AP－2)是一類具有細(xì)胞類型特異性結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子家族，在哺乳動物胚胎發(fā)育和細(xì)胞生長、分化以及凋亡中起重要的作用［1］。金屬基質(zhì)蛋白酶－20(matrix metalloproteinase 20，MMP20)主要在成釉細(xì)胞分泌期降解釉質(zhì)蛋白，是一種牙齒特異表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶，與釉質(zhì)發(fā)育密切相關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)MMP－20基因啟動子區(qū)含有AP－2結(jié)合位點，而且AP－2轉(zhuǎn)錄因子家族中 AP－2α 在成釉細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)［2－3］，本研究擬運用生物信息工具分析與MMP－20啟動子特征性序列相互作用的轉(zhuǎn)錄因子AP－2α，并通過一系列實驗探討AP－2α對MMP－20基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究釉質(zhì)發(fā)育過程中的基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒、UNIQ－10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、UNIQ－10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Bio Basic Inc公司，美國);PrimeSTAR HS DNA Polymerase、RNAiso Plus、PrimeScript? RT reagent Kit、siRNA－AP－2α(TaKaRa，日本);HindⅢ、XbaⅠ、BstxI、XhoI、MluI(NEB 公司，美國);Trans-Fast TMTransfection Reagent、Dual－Luciferase? 雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司，美國);SYBR Green PCR Master Mix(Roche公司，瑞士)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker#SM0331(Fermentas公司，美國);胎牛血清 (杭州四季青公司)，胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)，IQ5TM PCR儀(Bio－Rad公司，美國);Protein A Agarose beads(Upstate公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠 AP－2α 基因克隆及重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 的構(gòu)建

小鼠成釉細(xì)胞系為日本秋田大學(xué)Sugiyama等饋贈。將傳至第三代的成釉細(xì)胞用RNAiso Plus提取Total RNA，再用M－MLV RTase cDNA Synthesis Kit(寶生物)合成cDNA(小鼠總DNA)作為PCR的模板。根據(jù)Genbank中公布的小鼠AP－2α基因序列及引物設(shè)原則，利用Primer primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計。上游:5'－GGAAGCTTGGATGTTAGTTCACAGTT－3'(HindⅢ);下 游:5'－GCGGTCTAGACTTTCTGTGTTTCTC－3'(XbaI)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。預(yù)擴(kuò)增AP－2α mRNA的1293個堿基DNA片段，PCR反應(yīng)條件為35個循環(huán):98℃ 10 s，59℃ 15 s，72℃ 3 min。經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α，并進(jìn)行酶切及測序鑒定(南京金斯瑞公司)。正確者命名為 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α。

1.2.2 RNA 干擾阻斷 AP－2α 表達(dá)時 AP－2α 和MMP－20 mRNA 的表達(dá)

依據(jù)Elbashir等提出的小干擾RNA設(shè)計原則設(shè)計一對靶向AP－2α基因的特異性雙鏈 siRNA(siRNA－AP－2α)。HPLC 級別純化的雙鏈 siRNA和作為RNA干擾陰性對照的一對無關(guān)siRNA均在TaKaRa公司合成。以雙鏈siRNA瞬時轉(zhuǎn)染60 h后的成釉細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行實時定量PCR。引物序列:內(nèi)參對照GAPDH，F(xiàn):5’－TGTGTCCGTCGTGGATCTGA－3’;R:5’－TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG － 3’;MMP20， F:5’－GGCGAGATGGTGGCAAGAG－3’;R:5’－CTGGGAAGAGGCGGTAGTT－3’;AP－2α，F(xiàn):5' －GGAGAGCGAAGTCTAAGAATGG－3’;R:5’－TAGTGACGTGAGGAGGGTAACG－3’。反應(yīng)條件 94℃4 min，94 ℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 25 s，80℃ 15 s采集熒光，40個循環(huán)后72℃延伸1 min。反應(yīng)在IQ5TMPCR儀進(jìn)行，每個樣本3個復(fù)孔，重復(fù)3次。CT值由熒光PCR儀在擴(kuò)增過程中自動讀出，所得CT值結(jié)果進(jìn)行2－△△ CT分析［5］。

1.2.3 AP－2α 不同劑量過表達(dá)時對 MMP－20 基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

成釉細(xì)胞長至70% ～80%匯合時，按照Trans-FastTM Transfection Reagent說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。成釉細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA作為陰性對照，pRL40質(zhì)粒作為內(nèi)參照，實驗分為5組，組1:10 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 質(zhì)粒，390 ng空質(zhì)粒 pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA;組 2:50 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 質(zhì)粒，350 ng空質(zhì)粒pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA;組3:100 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 質(zhì)粒，300 ng 空質(zhì)粒 pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA;組4:400 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 質(zhì)粒，0 ng空質(zhì)粒 pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA;組 5:0 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 質(zhì)粒，400 ng空質(zhì)粒pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA。每組各加入構(gòu)建的pGL3 －MMP－20(511 bp)質(zhì)粒400 ng。參照 Dual－Luciferase?雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值(U1)及海腎熒光素酶(Renilla luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值(U2)。以每一樣品所測U1/U2之比為該質(zhì)粒報告基因的熒光素酶相對活性。每組3個復(fù)孔，重復(fù)3次。根據(jù)此實驗檢測結(jié)果，將均轉(zhuǎn)染 pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 400 ng者用于后續(xù)實驗。

1.2.4 AP－2α 過表達(dá)時不同長度 MMP－20 基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性變化

按照TransFastTM Transfection Reagent說明書進(jìn)行重組質(zhì)粒pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 瞬時轉(zhuǎn)染小鼠成釉細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA的成釉細(xì)胞作為陰性對照(control)，pRL40質(zhì)粒作為內(nèi)參照，實驗分為10組，組1:400 ng空質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA+400 ng pGL3 －MMP－20(102bp);組 2:400 ng空質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA+400 ng pGL3－MMP－20(197bp);組 3:400 ng空質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA+400 ng pGL3－MMP－20(394 bp);組 4:400 ng 空質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA+400ng pGL3－MMP－20(511bp);組 5:400ng空質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA+400ng pGL3－MMP－20(1200 bp);組6:400 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(102bp);組7:400ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP －2α +400 ng pGL3－MMP－20(197bp);組 8:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA －AP－2α +400ng pGL3－MMP－20(394bp);組 9:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA －AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)，組 10:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(1200 bp)。參照 Dual－Luciferase? 雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測。本研究每組3個復(fù)孔，重復(fù)3次。根據(jù)此實驗檢測結(jié)果，后續(xù)實驗將對MMP－20啟動子511 bp(－488～+23)片段進(jìn)行研究。

1.2.5 染色體免疫共沉淀技術(shù)研究 AP－2α 與MMP－20啟動子的相互作用

成釉細(xì)胞無血清DMEM培養(yǎng)48 h后，400 nmoL/L PMA刺激30 min。細(xì)胞經(jīng)甲醛交聯(lián)后，以每5管大約3×107個細(xì)胞分裝。SDS Lysis Buffer裂解細(xì)胞并進(jìn)行超聲處理(200 bp～1000 bp)(取部分用于Input)后，加入適量含1 mmoL/L PMSF的ChIP Dilution Buffer進(jìn)行稀釋，使最終OD260為2。實驗組按濃度1∶500滴加兔抗鼠AP－2α抗體(Santa Cruz公司)，同時IgG組滴加等濃度的羊抗兔無關(guān)抗體，陰性對照不加任何抗體，4℃孵育過夜。實驗組和對照組分別加入適量Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，在4℃孵育60 min后，對沉淀進(jìn)行洗滌并用Elution buffer洗脫。經(jīng)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)及蛋白消化后，以純化DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用TFSEARCH、AliBaba 2.1 工具分析得到 AP－2α 與MMP－20結(jié)合的特征性序列GCCTGTGGG，對預(yù)測的結(jié)合位點設(shè)計一對引物:上游:5’－ATGTAGGTCCTGGGGAATGAAC－3’，下 游:5’－GCTATGTACAGAAATTGGTATGAGC－3’，預(yù)擴(kuò)增片段為183 bp(大連寶生物公司合成)。分別用 1、2、5、8 μL 的 Input作為模板摸索出相應(yīng)的PCR條件，并選擇一組效果較好的用于最終的PCR檢測。PCR反應(yīng)條件為35個循環(huán):94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL反應(yīng)液進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照。

1.2.6 小鼠 MMP－20基因啟動子特征性序列的定點突變

根據(jù)以上實驗結(jié)果并利用生物信息工具，將特征性序列GCCTGTGGG定點突變?yōu)镚TTTGTAAG，并設(shè)計突變引物，上游:5’－GCTTGTTTGTAAGTGCAAATAAAGAG－3’，下游:5’－CTGATGACCTGGGTTCATTCC－3’(大連寶生物公司合成)。然后以本實驗室提供的重組質(zhì)粒 pMD18－T－MMP－20(－488～ +23，511bp)為模板，按照 TaKaRa MutanBEST Kit說明書進(jìn)行定點突變，并構(gòu)建小鼠pGL3－MMP－20突變質(zhì)粒。通過單酶切(MluI酶)和DNA序列分析(南京金斯瑞公司完成)進(jìn)行鑒定，正確者命名為pGL3－MMP－20突變體。

1.2.7 AP－2α過表達(dá)及RNA干擾阻斷其表達(dá)時野生型和突變型MMP－20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性變化

重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 瞬時轉(zhuǎn)染小鼠成釉細(xì)胞。pRL40質(zhì)粒作為內(nèi)參照，將實驗分為 4組，組 1:400 ng空質(zhì)粒 pcDNA 3.1/myc－h(huán)isA+400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;組2:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;組 3:400 ng空質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA+400 ng pGL3 －MMP －20(511 bp)突變型;組4:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)突變型。每組3個復(fù)孔，重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)30 h后，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測。

雙鏈siRNA瞬時轉(zhuǎn)染小鼠成釉細(xì)胞，48 h后進(jìn)行野生型MMP－20基因啟動子和突變型MMP－20基因啟動子瞬時轉(zhuǎn)染。pRL40質(zhì)粒作為內(nèi)參照，將實驗分為4組，組1:無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染情況下400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;組 2:雙鏈siRNA轉(zhuǎn)染情況下400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;組 3:無關(guān) siRNA轉(zhuǎn)染情況下 400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)突變型;組4:雙鏈 siRNA轉(zhuǎn)染情況下400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)突變型。每組3個復(fù)孔，重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較用配對t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠AP－2α 基因的克隆

小鼠AP－2α基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，該條帶大小與目的片段的大小一致(圖1a)。重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α的酶切鑒定如圖1b所示:單酶切所得片段大小為6719 bp;雙酶切釋放的片段為1396 bp，余下的片段為5323 bp，與預(yù)測結(jié)果一致。經(jīng)初步鑒定正確的重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 送由金斯瑞公司進(jìn)行序列分析，得到的基因測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析后，與GenBank中登錄基因序列完全一致，無點突變及移碼突變發(fā)生(圖1c)。

2.2 RNA 干擾阻斷 AP－2α 表達(dá)時 AP－2α 和MMP－20 mRNA表達(dá)變化

成釉細(xì)胞中轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA和siRNA－AP－2α后，60 h時發(fā)現(xiàn)AP－2α mRNA表達(dá)水平后者比前者下降約30%，表明AP－2α siRNA對AP－2α基因表達(dá)的干擾效果較好(P＜0.05);MMP－20 mRNA 表達(dá)水平后者比前者上升1.9倍，表明小鼠轉(zhuǎn)錄因子AP－2α對MMP－20的表達(dá)有抑制作用(P ＜0.05)(圖2)。

2.3 AP－2α 不同劑量過表達(dá)時對 MMP－20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

隨著AP－2α轉(zhuǎn)染劑量的增長，MMP－20啟動子的熒光素酶活性明顯減弱，說明小鼠轉(zhuǎn)錄因子AP－2α對MMP－20的表達(dá)有抑制作用，并且AP－2α在轉(zhuǎn)染400 ng時對MMP－20啟動子表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)(P ＜0.05)(圖 3a)。因此，將均轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 400ng用于后續(xù)試驗。

在檢測轉(zhuǎn)錄因子AP－2α過表達(dá)時不同長度小鼠MMP－20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性變化發(fā)現(xiàn)，400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA 比較，小鼠轉(zhuǎn)錄因子 AP－2α 對MMP－20啟動子(－488～+23)511 bp片段的表達(dá)抑制作用最明顯(P＜0.05)(圖3b)。因此，后續(xù)實驗將對MMP－20啟動子511 bp片段進(jìn)行研究。

2.4 AP－2α 與 MMP－20 啟動子的相互作用

超聲結(jié)束后，取少量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察超聲處理對于基因組DNA的剪切效果。如圖4a所示，DNA大部分已斷裂成200～1000 bp大小的片段，可繼續(xù)下步實驗。染色體免疫共沉淀實驗結(jié)果擴(kuò)增出大小為183 bp的片段，顯示模板中含有預(yù)測的結(jié)合位點，表明小鼠MMP－20啟動子序列與AP－2α可能在此位點結(jié)合(圖4b)，并為特征性序列的定點突變提供依據(jù)。

2.5 AP－2α過表達(dá)及RNA干擾阻斷其表達(dá)時野生型和突變型MMP－20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性變化

以實驗室提供的重組質(zhì)粒pMD18－T－MMP－20(－488～+23，511bp)為模板，將特征性序列GCCTGTGGG定點突變?yōu)?GTTTGTAAG，PGL3－MMP－20(511 bp)構(gòu)建突變質(zhì)粒，經(jīng)酶切和DNA序列分析進(jìn)行鑒定，突變體在預(yù)期位點發(fā)生突變(圖5a)。

pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 400 ng轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1/myc－h(huán)isA比較，野生型 pGL3－MMP－20(511 bp)比突變型pGL3－MMP－20(511 bp)熒光素酶活性下降率高(P＜0.05)，表明對特征性序列進(jìn)行突變后，AP－2α對MMP－20啟動子511 bp片段的表達(dá)幾乎無抑制作用(圖5b)。成釉細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA－AP－2α后檢測結(jié)果顯示，與無關(guān)siRNA相比較，野生型pGL3－MMP－20(511bp)表達(dá)水平升高，而突變型pGL3－MMP－20(511 bp)表達(dá)水平則降低(P ＜0.05)。不僅表明 AP－2α siRNA 對AP－2α 基因表達(dá)的干擾效果較好，消除了AP－2α對MMP－20啟動子的抑制作用;而且表明了特征性序列突變后，AP－2α siRNA 對 MMP－20啟動子的表達(dá)水平無顯著影響(圖5c)。再一次證明了轉(zhuǎn)錄因子AP－2α通過與MMP－20基因啟動子特征性序列相互作用，從而抑制MMP－20表達(dá)。

圖1 小鼠AP－2α基因的克隆

圖2 RT－PCR檢測RNA干擾阻斷轉(zhuǎn)錄因子 AP－2α 表達(dá)時 AP－2α 和 MMP－20 mRNA的表達(dá)

圖3 雙熒光素酶報告基因檢測AP－2α不同劑量過表達(dá)時不同長度MMP－20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性變化

圖4 染色體免疫共沉淀研究AP－2α與MMP－20啟動子的相互作用

圖5 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測野生型(WT)和突變型(MUT)MMP－20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)是一個大家族，是自然進(jìn)化中高度保守的一類酶，參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的蛋白酶家族。其中MMP－20的表達(dá)始于釉質(zhì)分泌的早期階段，是降解釉質(zhì)基質(zhì)蛋白的主要蛋白酶［2－3］，能促進(jìn)羥基磷灰石的沉積，利于釉質(zhì)的礦化。

AP－2是一類具有細(xì)胞類型特異性結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子家族，通過激活基因選擇性地表達(dá)，參與一系列細(xì)胞生命活動，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控;在哺乳動物的胚胎發(fā)育過程中也扮演重要角色。到目前為止，在人類和小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5個AP－2 家族成員，分別為 AP－2α，AP－2β，AP－2γ，AP－2δ and AP－2ε［1］，其中 AP－2 轉(zhuǎn)錄因子能雙向調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。AP－2通過調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄活動，影響細(xì)胞生命活動、細(xì)胞間穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育等［2］。在 AP－2 家族中，AP－2α (activating protein)發(fā)現(xiàn)最早，是轉(zhuǎn)錄因子AP－2家族中的重要一員，在哺乳動物胚胎發(fā)育和細(xì)胞生長、分化和凋亡中起重要的作用［3－5］，其抑癌效應(yīng)也最為明確。敲除AP－2α基因的小鼠，可導(dǎo)致神經(jīng)管、面部、眼和四肢的胚胎形成受到影響［2］。國內(nèi)外對小鼠AP－2的研究多集中在癌癥方面，而關(guān)于AP－2對釉質(zhì)的影響目前尚無較多報道，該方面的研究將是探討由MMP－20基因引起釉質(zhì)發(fā)育疾病的一個重要切入點。本實驗室在對小鼠成釉細(xì)胞內(nèi)AP－2家族成員進(jìn)行研究的過程中發(fā)現(xiàn)，AP－2α的表達(dá)最強(qiáng)，因此本實驗選用AP－2α進(jìn)行深入研究，探索其對MMP－20的調(diào)節(jié)作用，從而對釉質(zhì)發(fā)育的影響。

本研究對小鼠AP－2α基因克隆后，進(jìn)行RNA干擾阻斷轉(zhuǎn)錄因子AP－2α表達(dá)，通過RT－PCR檢測發(fā)現(xiàn)小鼠轉(zhuǎn)錄因子AP－2α對MMP－20的表達(dá)有抑制作用。再利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，檢測出小鼠轉(zhuǎn)錄因子AP－2α在轉(zhuǎn)染400 ng時對MMP－20啟動子表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)，并且在轉(zhuǎn)染400 ng時對MMP－20啟動子511 bp片段的表達(dá)抑制作用最明顯。根據(jù)此實驗檢測結(jié)果，將均轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 400 ng者用于后續(xù)實驗，并進(jìn)一步對MMP－20啟動子511bp(－488～+23)片段進(jìn)行深入研究。利用染色體免疫共沉淀技術(shù)驗證了AP－2α可能與MMP－20啟動子特征性序列結(jié)合，調(diào)控MMP－20表達(dá);進(jìn)行小鼠MMP－20基因啟動子特征性序列的定點突變，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測AP－2α過表達(dá)和RNA干擾阻斷轉(zhuǎn)錄因子AP－2α?xí)r野生型和突變型MMP－20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果進(jìn)一步說明了轉(zhuǎn)錄因子AP－2α通過與MMP－20基因啟動子特征性序列相結(jié)合，從而抑制MMP－20表達(dá)。本結(jié)果提示，小鼠AP－2α轉(zhuǎn)錄因子可與成釉細(xì)胞內(nèi)MMP－20啟動子的特征性序列相互作用，從而調(diào)控MMP－20的表達(dá)水平，在釉質(zhì)形成過程中發(fā)揮作用，對于釉質(zhì)疾病的預(yù)防及治療具有潛在的指導(dǎo)意義。

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