彭 博，臧圣奇，劉敏杰，馬志偉，王新文，劉玲俠，王勤濤

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032)

牙周病是危害人類口腔和全身健康的主要口腔疾病，其所導(dǎo)致牙周支持組織喪失，是成年人牙齒喪失的主要原因之一。牙周治療的目標(biāo)不僅是控制炎癥，更在于使已破壞的牙周組織再生以形成新附著。傳統(tǒng)的牙周治療和引導(dǎo)組織再生技術(shù)雖取得一定的臨床效果，但尚不能達(dá)到上述目的。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，為牙周病的治療開辟了新的思路和方法，而具有良好生物性能的支架材料一直是組織工程學(xué)研究的重點(diǎn)。

殼聚糖溫敏凝膠是一種天然來源的聚陽離子生物聚合體，由于其來源廣泛，且具有無毒性［1］、良好的生物相容性［2］和可降解性［3－4］、抗菌活性［5］、粘附性［6］以及促進(jìn)組織再生等良好性能［7］，已作為藥物緩釋系統(tǒng)［8］和支架材料［9］在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域得到了深入的研究和廣泛的應(yīng)用。

然而，傳統(tǒng)的消毒方法會(huì)導(dǎo)致殼聚糖凝膠的物理性能不穩(wěn)定，從而限制了在牙周組織工程中的應(yīng)用，本研究通過改變殼聚糖的消毒方法，檢測(cè)其凝膠化時(shí)間和粘度，并觀察人牙周膜細(xì)胞在凝膠表面和凝膠浸提液中增殖情況，為其能作為更穩(wěn)定的牙周組織工程支架材料提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

殼聚糖(448877，DD≥85%，sigma公司，美國);β－甘油磷酸鈉(β－GP;醫(yī)藥級(jí)，Merck公司，德國);α－MEM 培養(yǎng)基(Hyclone，美國);胎牛血清(北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司);電子天平(JY2002，上海良平儀表);0.22 μm 除菌濾器、酶標(biāo)儀(TECAN sunrise，奧地利);倒置熒光顯微鏡(Leica DM6000B，德國 )。

1.2 兩種消毒方法制備殼聚糖溫敏凝膠

1.2.1 傳統(tǒng)消毒方法制備殼聚糖溫敏凝膠

稱取0.2 g殼聚糖粉置于試劑瓶?jī)?nèi)，室溫下逐步加入9 mL稀鹽酸(0.1 mol/L)，磁力攪拌器攪拌2 h，直至殼聚糖粉完全溶解，配制成的殼聚糖－鹽酸液，經(jīng)高溫高壓消毒(120℃，10 min)后作為A液;另取0.56 g β－GP溶解于1 mL雙蒸水中，配制成濃度為560 g/L的 β－GP液，超凈臺(tái)內(nèi)用0.22 μm 除菌濾器過濾消毒作為B液;A、B兩種溶液冰浴15 min后，超凈臺(tái)內(nèi)將B液逐滴加入A液中，攪拌10 min，即獲得終濃度為20 g/L的殼聚糖溫敏凝膠。

1.2.2 改進(jìn)消毒法制備殼聚糖溫敏凝膠

稱取0.2 g殼聚糖粉置于試劑瓶?jī)?nèi)，先單獨(dú)進(jìn)行高溫高壓消毒(120℃/10 min)后，再加入9 mL鹽酸液，磁力攪拌器攪拌2 h直至完全溶解配成A液，然后再按1.2.1相同的方法制備B液和溫敏凝膠。

1.3 殼聚糖溫敏凝膠凝膠化效果觀察

凝膠化效果采用倒置法觀察，分別將裝有不同消毒方法制備的殼聚糖溶膠的燒杯置于37℃水浴箱內(nèi)，每1 min倒置觀察1次，燒杯倒置30 s之內(nèi)凝膠無流動(dòng)為凝膠化成功。

1.4 殼聚糖溫敏凝膠粘度檢測(cè)

取兩種消毒方法配制的殼聚糖溫敏凝膠各10 mL，分別置于粘度測(cè)試儀內(nèi)(Brookfield HBT)，將粘度儀溫度設(shè)為37℃，轉(zhuǎn)子(1號(hào)轉(zhuǎn)子)轉(zhuǎn)速設(shè)定為 1.0 r/min，分別于 0、1、3、5、10、15、20、30 min各測(cè)試一次粘度。

1.5 超微結(jié)構(gòu)觀察

分別取兩種消毒方法配制的殼聚糖溫敏凝膠，梯度脫水、抽真空、凍干、噴金，掃描電鏡下觀察。

1.6 殼聚糖溫敏凝膠生物相容性實(shí)驗(yàn)

1.6.1 人牙周膜細(xì)胞體外培養(yǎng)

取18歲以上志愿者因正畸減數(shù)拔除的前磨牙，刮取根中1/3處牙周膜，采用酶消化法原代培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞，3 d換培養(yǎng)液1次常規(guī)傳代后，取生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 牙周膜細(xì)胞在兩種溫敏凝膠表面生長(zhǎng)情況觀察

取生長(zhǎng)良好的第3代人牙周膜細(xì)胞，以1×104/cm2接種在兩種消毒方法制備的凝膠表面，放入孵箱內(nèi)，37℃，50 mL/L CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3 d換培養(yǎng)液1次，7 d后分別取出凝膠，用40 g/L多聚甲醛液固定，避光條件下DAPI染色，熒光倒置顯微鏡觀察。

1.6.3 兩種溫敏凝膠浸提液對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖的影響

分別取兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠各5 mL，置于50 mL無菌試劑瓶中，加入45 mL含100 mL/L胎牛血清的α－MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃下浸提24 h后吸取培養(yǎng)液作為浸提液用于實(shí)驗(yàn)。

取生長(zhǎng)良好的第三代牙周膜細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×104/mL的單細(xì)胞懸液，以200 μL/孔接種于96孔板，置37℃ 、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中孵育，24 h后，棄原培養(yǎng)液，并將細(xì)胞隨機(jī)分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組復(fù)5個(gè)孔。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入2種消毒方法制備的凝膠浸提液;空白對(duì)照組加入含100 mL/L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3 d換液1次，分別于培養(yǎng)后的1、2、3、4、5、6、7 d 取出各組細(xì)胞，于每孔中加入 20 μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm處的吸光值(OD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩種消毒方法殼聚糖溫敏凝膠溫敏特性比較

兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠pH均在6.8～7.2，凝膠化前均呈微黃色、透明、可流動(dòng)溶膠狀(圖1a)，置于37℃水浴箱內(nèi)，常規(guī)消毒組凝膠化時(shí)間為10～30 min，改進(jìn)消毒組凝膠化時(shí)間為5～6 min，凝膠化后呈微黃色半透明不可流動(dòng)膠凍狀(圖1b)，兩種殼聚糖溫敏凝膠凝膠化后均不會(huì)變回可流動(dòng)溶膠狀。

2.2 兩種消毒方法殼聚糖溫敏凝膠粘度比較

改進(jìn)消毒法組殼聚糖溫敏凝膠初始粘度為(9.94 ±0.38)Pa.s，隨著在 37 ℃水浴箱內(nèi)的時(shí)間增長(zhǎng)，其粘度逐漸升高，10 min時(shí)達(dá)到峰值(50.25 ±0.96)Pa.s，此后不再隨著時(shí)間而有明顯變化;常規(guī)消毒法組殼聚糖溫敏凝膠初始粘度為(0.90 ±0.45)Pa.s，在37 ℃水浴箱內(nèi)，其粘度隨時(shí)間延長(zhǎng)稍有增加，但變化不明顯，15 min時(shí)僅為(4.05 ±0.72)Pa.s，此后趨于平穩(wěn)，兩組各時(shí)間點(diǎn)粘度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。

2.3 兩種消毒法殼聚糖溫敏凝膠超微結(jié)構(gòu)

兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠均呈三維立體網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)有大量排列不規(guī)則的微孔隙，常規(guī)消毒法殼聚糖溫敏凝膠孔徑為10～48.33 μm(圖3a);改進(jìn)消毒法殼聚糖溫敏凝膠孔徑為0.385 ～2 μm(圖3b)。

圖1 殼聚糖溫敏凝膠凝膠化前后一般性狀

圖2 兩組殼聚糖溫敏凝膠粘度變化曲線

圖3 兩組殼聚糖溫敏凝膠電鏡下超微結(jié)構(gòu)(×10000)

2.4 人牙周膜細(xì)胞在兩種溫敏凝膠表面生長(zhǎng)情況

在兩種消毒法制備的殼聚糖溫敏凝膠表面培養(yǎng)7 d的牙周膜細(xì)胞，經(jīng)dapi染色后倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，胞核大小均一，數(shù)量眾多(圖4)，表明生長(zhǎng)情況良好，提示兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠與牙周膜細(xì)胞相容性均良好。

圖4 人牙周膜細(xì)胞在兩組殼聚糖溫敏凝膠表面生長(zhǎng)情況

2.5 兩種溫敏凝膠浸提液對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖的影響

通過MTT檢測(cè)，兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠浸提液組在培養(yǎng)后 1、2、3、4、5、6、7 d 各時(shí)間點(diǎn)的增殖情況相近，且均與空白對(duì)照組無顯著性差異(P ＞0.05)，3組生長(zhǎng)曲線均呈“S”形(圖5)。

圖5 兩種溫敏凝膠浸提液對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖的影響

3 討論

殼聚糖溫敏凝膠材料因其具有流動(dòng)性好，可與生長(zhǎng)因子、種子細(xì)胞混合，植入時(shí)手術(shù)創(chuàng)傷小等諸多優(yōu)點(diǎn)，而成為牙周組織工程領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)［10］。作為溫敏型的凝膠材料，其在室溫下或者低于室溫時(shí)可保持流動(dòng)性，而溫度達(dá)到體溫時(shí)則可凝膠化，這種體溫固化的自適應(yīng)性能，是其他支架材料不可比擬的。

殼聚糖溫敏凝膠中殼聚糖的濃度多為1.80% ～2.35%，能被 0.1 mol/L 的鹽酸液溶解，β－GP液濃度一般為45% ～56%(w/v)，殼聚糖溫敏凝膠溫敏自凝化機(jī)制的產(chǎn)生在pH值為6.8～7.2時(shí)，一般認(rèn)為是由于甘油磷酸鈉的加入，直接影響了殼聚糖分子鏈之間的靜電力、疏水作用和氫鍵的結(jié)果，甘油磷酸鈉的弱堿性和殼聚糖上的胺基相互作用、吸引，使甘油部分暴露，殼聚糖鏈分解，在室溫或者低于室溫下，殼聚糖水凝膠保持液態(tài);當(dāng)溫度提高至接近人體體溫(37℃)時(shí)，由于疏水鍵和氫鍵的引力大于鏈間靜電排斥力，殼聚糖分子鏈間的部分片段發(fā)生物理結(jié)合，從而出現(xiàn)凝膠化。而pH值較低時(shí)由于存在鏈間靜電排斥力，阻礙了氫鍵形成，使得凝膠化所需的初始溫度較高。殼聚糖水凝膠在低溫(4℃)時(shí)也可以凝膠，只不過凝膠時(shí)間很長(zhǎng)，最長(zhǎng)可達(dá)3個(gè)月。

目前對(duì)殼聚糖溫敏凝膠的消毒方法，一般采用將殼聚糖溶解于鹽酸液后再高溫高壓消毒(120 ℃，10 min)，β－GP 液用0.22 μm 除菌濾器過濾消毒，然后將再兩種溶液混合的方案。Jarry等［11－12］發(fā)現(xiàn)殼聚糖鹽酸液經(jīng)高溫高壓消毒后會(huì)導(dǎo)致最終殼聚糖凝膠分子質(zhì)量損失30%，動(dòng)態(tài)粘度降低3～10倍，力學(xué)性能明顯降低，雖然添加多元醇可以消除部分高溫高壓消毒帶來的負(fù)面影響，添加葡萄糖可以提高凝膠粘度和強(qiáng)度，但程度有限，且不適用于糖尿病病人。本研究發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠，其凝膠化時(shí)間不穩(wěn)定，甚至有長(zhǎng)時(shí)間不凝膠化等現(xiàn)象。

殼聚糖的脫乙酰度也是影響殼聚糖溫敏凝膠凝膠化的重要因素，關(guān)于殼聚糖溫敏凝膠文獻(xiàn)報(bào)道中，殼聚糖脫乙酰度多為 85% ～95%。Chenite［13］、Ruel－Gariepy 等［14］在比較不同脫乙酰度和相對(duì)分子量的殼聚糖制備的溫敏凝膠流變學(xué)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，脫乙酰度越高則凝膠化溫度越低，凝膠化時(shí)間縮短，反之則凝膠化所需溫度升高，時(shí)間延長(zhǎng);而相對(duì)分子量對(duì)凝膠溫度影響不大;此外，脫乙酰度還是影響炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因素，脫乙酰度越低，炎性反應(yīng)越大，脫乙酰度越高，炎性反應(yīng)越小。但殼聚糖脫乙酰度為平均值，同批次產(chǎn)品有不同差異，從而導(dǎo)致殼聚糖凝膠化時(shí)間不穩(wěn)定，如果凝膠時(shí)間過長(zhǎng)，殼聚糖溫敏凝膠在體內(nèi)未凝膠化之前容易被體液或者血液稀釋，不易滯留患處，凝膠化后，其力學(xué)強(qiáng)度也降低，從而影響支架材料的效果。

本研究對(duì)殼聚糖溫敏凝膠的消毒方法進(jìn)行了改進(jìn)，先單獨(dú)對(duì)殼聚糖粉進(jìn)行高溫高壓消毒(120℃，10 min)，然后再用鹽酸液溶解。用此法制備的殼聚糖溫敏凝膠粘度有明顯的增加，從初始粘度到終粘度，均較常規(guī)消毒法殼聚糖溫敏凝膠組有明顯提高。這可能由于殼聚糖在高溫狀況下，鏈與鏈之間發(fā)生聚合，相對(duì)分子質(zhì)量增大所致。另有文獻(xiàn)報(bào)道高溫高壓消毒對(duì)殼聚糖的其他理化性質(zhì)影響不大［15］。改進(jìn)消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠的凝膠化時(shí)間為5～6 min，比傳統(tǒng)消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠凝膠化時(shí)間(10～30 min)明顯縮短，且凝膠時(shí)間更加穩(wěn)定，使材料注入體內(nèi)后更易駐留，同時(shí)還可作為生物粘合劑與其他顆粒狀固體材料(如骨移植材料)附合，使植入物更牢固的固定于受植區(qū)而不易脫落。

此外掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠均呈三維立體網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，含大量孔隙，但改進(jìn)消毒方法組殼聚糖溫敏凝膠的孔徑明顯小于常規(guī)消毒方法組。

Christiane等［16］報(bào)道，人 BMSCs細(xì)胞在殼聚糖支架材料表面伸展良好，生長(zhǎng)較快。Ashkan等［17］也證實(shí)，人成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在殼聚糖支架上生長(zhǎng)良好。牙周膜細(xì)胞是牙周組織的主要功能細(xì)胞，在牙周組織再生中起到了重要的作用，是具有多種生物學(xué)功能和分化潛能的細(xì)胞群，是牙周組織再生修復(fù)的重要細(xì)胞，本研究分別觀察了兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠及其浸提液對(duì)第三代人牙周膜細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，人牙周膜細(xì)胞在兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠表面及其浸提液中均生長(zhǎng)良好，說明兩種消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠均具有良好的生物相容性。采用改進(jìn)消毒方法制備的殼聚糖溫敏凝膠凝膠化時(shí)間更短、粘度更大，且與常規(guī)消毒方法一樣擁有良好的生物相容性。

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