劉宗霞，王 建，李 紓，楊春俞

(山東:1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，濰坊 261053;2.濰坊口腔醫(yī)院，濰坊 261011;3.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周病科，山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，濟(jì)南 250012)

牙的萌出是牙胚、牙槽骨以及諸多細(xì)胞及其分子相互作用且復(fù)雜有序的生理過程。這一過程需要在牙胚的冠方形成萌出通道，即由鄰近牙槽骨吸收形成硬組織通道，并且軟組織通過吸收改建而形成軟組織通道。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是參與牙萌出的關(guān)鍵性調(diào)控因子之一，Cohen(1962)首先發(fā)現(xiàn)將EGF注射到新生小鼠體內(nèi)可以使切牙早熟性地萌出［1］，并且Hoath等［2］證實在大鼠出生后0～3 d注射EGF，其促萌效果最佳，但其是否參與軟、硬組織通道的形成尚不清楚。

本研究通過觀察EGF/EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生長因子受體)在牙齒萌出前后口腔黏膜中的表達(dá)差異，研究EGF是否參與牙齒萌出通道的形成;通過研究EGF與牙囊細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白－1(monocyte chemotactic protein－one，MCP－1)的關(guān)系，探討其在牙槽骨的吸收，即硬組織通道形成過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

出生后不同發(fā)育期SPF級BALB/c小鼠、SPF級4～6 d齡Wistar大鼠(山東大學(xué)動物中心提供);PV二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB試劑盒(邁新生物技術(shù)公司);α－MEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國);胎牛血清(FBS)(杭州四季青);EGF(Sigma，美國);四唑鹽(MTT)、Trizol(上海生工生物工程有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas);PCR試劑盒(大連寶生物公司)。

1.2 EGF/EGFR在牙齒萌出過程中表達(dá)的組織學(xué)定位觀察

1.2.1 標(biāo)本處理

分別取出生后13、15 d以及牙齒已萌出完成的成年BALB/C小鼠各4只，引頸處死后，分離解剖含下頜第一磨牙的下頜骨，置新鮮配制40 g/L多聚甲醛中固定過夜，根據(jù)發(fā)育時期的不同，分別用100 g/L EDTA脫鈣液常溫脫鈣1～3月不等。梯度乙醇脫水，石蠟包埋，近中遠(yuǎn)中向5 μm連續(xù)切片，多聚賴氨酸包被的玻片撈片，60℃烤片2～3 h。HE染色觀察牙齒發(fā)育的情況。

1.2.2 免疫組化PV二步法檢測EGF/EGFR的表達(dá)

取上述各發(fā)育期小鼠的標(biāo)本，二甲苯脫蠟，梯度水化至水，30 mL/L過氧化氫液室溫孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;復(fù)合消化液消化5 min，蒸餾水洗，血清封閉，室溫孵育20 min，不洗，滴加一抗(1∶100稀釋)37℃孵育1 h，PBS漂洗;滴加羊抗鼠IgG抗體－HRP多聚體，37℃孵育20 min，PBS漂洗;DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相。陰性對照片用PBS分別代替一抗或二抗。

1.3 EGF對牙囊細(xì)胞增殖和MCP－1表達(dá)的影響

1.3.1 大鼠牙囊細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定

取出生后4～6 d的SPF級Wistar大鼠，參照Wise等［3］方法進(jìn)行牙囊細(xì)胞分離培養(yǎng)。即大鼠引頸處死后，浸入750 mL/L乙醇2～3 s，體視顯微鏡下分離下頜第一磨牙的牙胚，10 g/L胰蛋白酶液消化1.5 h，在體視顯微鏡下分離牙囊組織。然后將分離的牙囊組織置于培養(yǎng)瓶中，加入含200 mL/L FBS的 α－MEM 培養(yǎng)液，在37℃，50 mL/L CO2以及飽和濕度下培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下嚴(yán)密觀察細(xì)胞生長狀況，每3 d換液1次。待細(xì)胞單層生長達(dá)培養(yǎng)瓶底80%以上時，用胰蛋白酶消化法傳代培養(yǎng)，取第3代牙囊細(xì)胞進(jìn)行角蛋白、波絲蛋白免疫組化染色法鑒定細(xì)胞的組織來源，備用。

1.3.2 EGF對牙囊細(xì)胞增殖的影響

取生長良好的第3代牙囊細(xì)胞以2×104/孔接種于 96孔板，同時加入含 150 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液，37℃ 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)24 h，倒置相差顯微鏡下觀察，見大多數(shù)牙囊細(xì)胞貼壁并伸展后，棄去孔內(nèi)液體和未貼壁細(xì)胞，用無血清α－MEM培養(yǎng)液沖洗3次后，將細(xì)胞隨機(jī)分為5個實驗組和1個對照組共6組，每組復(fù)5孔。5個實驗組分別加入含EGF終末濃度為0.5、1、5、10和50 ng/mL的含5 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液，對照組加含5 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液，每孔100 μL。然后將96孔培養(yǎng)板放入37℃，50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，每孔中加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL 的DMSO，振蕩10 min，在分光光度儀490 nm波長下測吸光度(A)值。

1.3.3 RT－PCR 檢測 EGF 對牙囊細(xì)胞MCP－1mRNA表達(dá)的影響

1.3.3.1 牙囊細(xì)胞處理

取生長良好的第3代牙囊細(xì)胞，用2.5 g/L的胰蛋白酶液消化后，配成單細(xì)胞懸液并接種于直徑為70 mm培養(yǎng)皿中，加入含50 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液，37℃，50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。次日去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞生長至匯合點(diǎn)時，將細(xì)胞隨機(jī)分為4個實驗組和1個對照組。4個實驗組先用無血清的α－MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)5 h后，均換用含EGF終末濃度為10 ng/mL的無血清α－MEM培養(yǎng)液，并分別繼續(xù)孵育0.5、1、3、6 h 后終止培養(yǎng)。對照組用無血清的α－MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)5 h后終止培養(yǎng)。

1.3.3.2 RT－PCR 檢測

上述各組細(xì)胞終止培養(yǎng)后，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以 cDNA為模板擴(kuò)增MCP－1和內(nèi)參照β－actin。引物由上海博尚生物科技公司合成。

MCP－1分子引物序列:上游引物:5'GCAGGTCTCTGTCACGCTT3'，下游引物:5'GTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAA3'，該引物產(chǎn)生413 bp的cDNA片段。β－actin分子引物序列:上游引物:5'CCCTGAAGTACCCCATTGAA3'，下 游 引 物:5'CTTTTCACGGTTGGCCTTAG3'，該引物產(chǎn)生158 bp的cDNA片段。采用2 ×Taq PCR MasterMix 25 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件一致為:94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性 35 s、54.4 ℃退火35 s、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72℃延伸5 min。

1.3.3.3 PCR 產(chǎn)物鑒定和分析

取8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化已啶染色，DL 2000 Maker 5 μL作參照，80 V電壓下電泳，在紫外線箱中觀察并照相記錄。用UVP凝膠成像系統(tǒng)照相，并用JD801顯微圖像分析系統(tǒng)分析軟件測量其積分光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EGF/EGFR的組織學(xué)定位

小鼠出生后13 d時，在下頜第一磨牙冠方可觀察到退化的成釉細(xì)胞、口腔上皮、固有層，EGFR在其冠方口腔黏膜的全層包括基底層、棘層和角化層呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1)，EGF在口腔黏膜上皮呈弱陽性表達(dá)(圖2)。小鼠出生后15 d時，牙齒冠方的軟組織融合為實性的上皮細(xì)胞團(tuán)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)為空泡狀的凋亡狀態(tài)(圖3)。此時，EGFR僅在縮余釉上皮處呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其余部分表達(dá)明顯減弱，處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞無表達(dá)(圖4)。而EGF在實性上皮團(tuán)中呈陰性表達(dá)(圖3)。

在牙齒萌出后，EGFR的表達(dá)集中于上皮基底層(圖5)，EGF的表達(dá)集中于口腔黏膜的固有層(圖6)。

2.2 牙囊細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

與葛少華等［4］的實驗結(jié)果相似，牙囊組織培養(yǎng)24 h后便可見少數(shù)細(xì)胞從組織周圍爬出，14～21 d后細(xì)胞即可達(dá)單層匯合。主要有兩種細(xì)胞形態(tài)，一種細(xì)胞呈梭形，另一種細(xì)胞呈多角形，兩種細(xì)胞間雜在一起生長。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)陽性(圖7)，角蛋白表達(dá)陰性(圖8)，表明細(xì)胞源自間充質(zhì)。

2.3 EGF對牙囊細(xì)胞增殖的影響(表1)

EGF對牙囊細(xì)胞增殖的影響在濃度為5 ng/mL時開始顯效，10 ng/mL時達(dá)到最高，兩者與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。50 ng/mL時增殖活性開始降低，且與對照組無顯著性差異(P ＞0.05)。

表1 EGF對牙囊細(xì)胞增殖的影響(A490，)

表1 EGF對牙囊細(xì)胞增殖的影響(A490，)

*與對照組比較 P＜0.05

EGF(ng/mL)細(xì)胞增殖活性0.0(對照組)0.094 ±0.0090.5 0.107 ±0.0221.0 0.111 ±0.0195.0 0.116 ±0.012*10.0 0.125 ±0.006*50.0 0.103 ±0.008

2.4 EGF對體外培養(yǎng)的牙囊細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)的影響

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與基因庫中公布的MCP－1(M －57441)序列100%一致。MCP－1、β－actin 的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為413、158 bp(圖9)。牙囊細(xì)胞與10 ng/mL EGF 共同孵育0.5 h，牙囊細(xì)胞中MCP－1 mRNA表達(dá)開始升高，3 h表達(dá)最高，以后逐漸恢復(fù)，但仍比對照組高，即共同孵育 0.5、1、3、6 h 各時間點(diǎn)MCP－1 mRNA表達(dá)量均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖10)。

圖2 13 d小鼠，EGF在下頜第一磨牙冠方上皮層呈弱陽性表達(dá)(×20)

圖4 15 d小鼠，EGFR在縮余釉上皮中呈陽性表達(dá)，在實性上皮團(tuán)其余部分表達(dá)明顯減弱(×20)

圖5 牙齒萌出完成后，EGFR在牙齦上皮基底層呈陽性表達(dá)，在固有層中無表達(dá)(×20)

圖6 牙齒萌出完成后，EGF在牙齦固有層呈陽性表達(dá)，在上皮層中無表達(dá)(×20)

圖7 牙囊細(xì)胞抗波形絲蛋白染色呈陽性(棕黃色)，位于細(xì)胞漿中，胞核著色陰性(免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×20)

圖8 牙囊細(xì)胞抗角蛋白染色呈陰性，藍(lán)色為蘇木素復(fù)染的細(xì)胞核(免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×20)

圖9 EGF對牙囊細(xì)胞MCP－1表達(dá)的影響

3 討論

牙齒的萌出是在牙冠形成后，牙胚向牙合面移動，穿過骨隱窩和口腔黏膜，直至達(dá)到功能位置的一個復(fù)雜的過程。這一過程可分為3個時期:萌出前期、萌出期和萌出后期(或功能期)［5］。其中，萌出前期的主要變化是牙根形成時牙胚在牙槽骨中的移動，這一過程需要相應(yīng)部位的牙槽骨發(fā)生吸收和改建，以形成利于牙萌出的硬組織通道。在萌出期，覆蓋在牙冠表面的縮余釉上皮分泌多種酶，溶解結(jié)締組織，形成一個有上皮襯里的軟組織通道。因此我們可以認(rèn)為軟、硬組織通道的建立是牙得以順利萌出的關(guān)鍵所在。

圖10 EGF作用后牙囊細(xì)胞MCP－1mRNA表達(dá)的積分光密度值(*與對照組相比P＜0.05)

EGF屬于小分子多肽，是細(xì)胞生長因子的一類，與其受體結(jié)合，在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，包括促進(jìn)表皮生長和角化［6－7］，促進(jìn) DNA合成，引起細(xì)胞增殖等。EGF是參與牙萌出的重要調(diào)控因子之一，將其注射到新生大鼠體內(nèi)，可有效促進(jìn)磨牙的萌出［2］，但其具體的促萌機(jī)制尚不清楚。

Huvsseune等［8］通過光鏡和電子顯微鏡觀察斑馬魚第一副牙齒萌出過程，認(rèn)為上皮的改建在牙萌出過程中發(fā)揮著重要的作用。牙萌出時，縮余釉上皮分泌酶，溶解結(jié)締組織，加之萌出時上皮對結(jié)締組織的壓力，使結(jié)締組織破壞。這時，縮余釉上皮外層細(xì)胞和口腔上皮細(xì)胞增殖并移動到退變的結(jié)締組織處，在萌出牙的上方融合形成上皮團(tuán)，繼而上皮團(tuán)中央細(xì)胞死亡，形成一個有上皮襯里的牙萌出通道，通過該通道，牙萌出時不會發(fā)生出血［5］。本研究在15 d小鼠下頜第一磨牙的冠方觀察到實性的上皮細(xì)胞團(tuán)，符合上述理論。同時還發(fā)現(xiàn)，13 d時EGF在小鼠下頜第一磨牙冠方的口腔黏膜上皮層中呈弱陽性表達(dá)，而其在成年鼠的口腔黏膜中的表達(dá)僅限于固有層。Wise等［9］報道，在剛出生大鼠體內(nèi)注射EGF可以增加星網(wǎng)狀層細(xì)胞IL－1α的表達(dá)，提示在體外EGF也可促進(jìn)星網(wǎng)狀層細(xì)胞 IL－1α以及 IL－1α mRNA的表達(dá)。Modeer等［10］研究發(fā)現(xiàn)，EGF可促進(jìn) IL－1誘導(dǎo)前列腺素E2(PGE2)的生成。PGE2可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖及膠原的合成，并使基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)增加，從而促進(jìn)結(jié)締組織的溶解吸收。上述研究結(jié)果提示EGF可促進(jìn)結(jié)締組織的退變吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，牙齒萌出后，EGFR表達(dá)于口腔黏膜上皮的基底層，隨細(xì)胞向棘層分化而逐漸消失。而出生13 d時，EGFR在口腔黏膜的全層呈強(qiáng)陽性表達(dá)，高水平表達(dá)的EGFR明顯增強(qiáng)了上皮細(xì)胞對生長因子的反應(yīng)性，促進(jìn)它與受體結(jié)合形成復(fù)合物，這樣勢必促進(jìn)了口腔黏膜上皮的增殖分化進(jìn)程。這進(jìn)一步證實了牙齒萌出時，其冠方結(jié)締組織的退化吸收，上皮的增殖改建是實性上皮團(tuán)得以順利形成的關(guān)鍵。出生15 d時，在實性上皮團(tuán)中，EGF呈陰性表達(dá)，EGFR僅在退化的成釉上皮處維持強(qiáng)陽性表達(dá)，其余部分表達(dá)明顯減弱，處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞無表達(dá)。表明EGF/EGFR的相互作用集中于上皮改建的初期，即EGF可能主要在實性上皮團(tuán)的形成過程中發(fā)揮著積極的作用。由此可見EGF可能通過間接誘導(dǎo)PGE2的合成，促進(jìn)結(jié)締組織的溶解吸收，并且可促進(jìn)冠方上皮的增生融合，參與了上皮團(tuán)的形成，這可能在軟組織通道的形成中發(fā)揮著重要的作用。

單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊并在其中聚集是牙萌出的關(guān)鍵［11］，此后單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變成破骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞吸收牙槽骨以形成牙齒萌出的硬組織通道。本研究發(fā)現(xiàn):EGF具有促進(jìn)體外培養(yǎng)的牙囊細(xì)胞增殖的作用，且呈劑量依賴性，5～10 ng/mL EGF可顯著促進(jìn)牙囊細(xì)胞的增殖，10 ng/mL時增殖活性最強(qiáng)，50 ng/mL時增殖活性開始減弱。推測EGF可能通過促進(jìn)牙囊細(xì)胞中EGFR的表達(dá)，并與之結(jié)合，從而有效的促進(jìn)了牙囊細(xì)胞的增殖。EGF是否可通過促進(jìn)牙囊細(xì)胞的有絲分裂而參與牙的萌出有待進(jìn)一步研究，但現(xiàn)在至少可以證實EGF在維持牙囊細(xì)胞的增殖活性方面發(fā)揮著積極的作用。

選擇EGF的較佳效應(yīng)濃度10 ng/mL來檢測其對MCP－1的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 ng/mL的EGF具有促進(jìn)MCP－1表達(dá)的作用，共同培養(yǎng)0.5 h開始起效，在3 h表達(dá)增強(qiáng)最顯著，以后逐漸減弱。MCP－1表達(dá)的降低可能是由于大量外源性的EGF抑制了牙囊細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)，受體表達(dá)下降會減弱EGF上調(diào)MCP－1轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。Que等［12］研究證實，在大鼠體內(nèi)注射EGF同樣可促進(jìn)牙囊細(xì)胞中MCP－1的表達(dá)，進(jìn)一步證實了EGF對于MCP－1的上調(diào)作用。EGF通過促進(jìn)牙囊細(xì)胞分泌MCP－1，誘使單核細(xì)胞遷入牙囊，從而促進(jìn)硬組織通道的形成。

牙萌出是牙胚和周圍牙槽骨內(nèi)發(fā)生的多種與牙萌出相關(guān)的信號分子共同參與的復(fù)雜的激聯(lián)過程［13］，可能存在多種通路，EGF可能在軟、硬組織通道的形成過程中發(fā)揮著積極的作用，但其具體的過程仍不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

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