張 璟，楊 昊，高麗娜，安 瑩，陳發(fā)明，金 巖

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院，陜西西安 710032)

牙周病是一種以破壞牙周支持結(jié)構(gòu)，并最終導致牙齒脫落的慢性進展性疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計:美國有大約30%～40%的成年人患有不同程度的牙周疾病，在我國中老年人群中慢性牙周炎的發(fā)病率甚至高達70%，牙周炎的防治面臨嚴峻的形勢和挑戰(zhàn)［1］。傳統(tǒng)牙周治療方法例如超聲潔治、齦下刮治、翻瓣術(shù)，以及近年來廣泛開展的Vector治療、各種骨移植術(shù)等，都沒有達到預期的治療效果，特別是不能實現(xiàn)牙周組織的生理和功能性再生［2－4］。組織工程研究為牙周病的治療和牙周缺損的修復開辟了新的研究空間，特別是利用自體(智齒、正畸拔除的牙齒)來源的牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)治療牙周組織喪失在動物體內(nèi)取得了令人振奮的結(jié)果［5］，甚至有學者已經(jīng)開始臨床病例的嘗試［6］。然而目前開展的基礎(chǔ)和臨床研究中，多數(shù)沒有考慮到年齡因素對PDLSCs培養(yǎng)及其生物學特性的影響。本研究通過不同年齡智齒中牙周膜干細胞的分離、培養(yǎng)和對比分析，觀察＞50歲PDLSCs的生物學性能是否與＜30有明顯差異，為PDLSCs的應用研究是否要考慮年齡因素提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清FBS(四季青公司);α－MEM培養(yǎng)基、L－谷氨酰胺、青鏈霉素(Gibco，美國);2.5 g/L胰蛋白酶(Amresco，美國);Dispase(Roche，美國);I型膠原酶、地塞米松、β－甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅、油紅 O(Sigma，美國);抗 CD29、抗CD31、抗 CD34、抗 CD44、抗 CD90、抗 CD105、抗CD146、抗 STRO－1 抗體(R＆D Systems，美國);50 g/L、90 g/L、170 g/L EDTA(Pulpdent，美國);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國);離心機(Kubota2l00，日本);YJ－875 型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)(IX70)、體視顯微鏡(Olympus，日本);6孔培養(yǎng)板、平底 96孔板(Falcon，美國);流式細胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，美國);超聲震蕩儀(上海生源器械廠)。

1.2 人牙周膜細胞的原代培養(yǎng)

人牙周膜細胞的原代培養(yǎng)參照文獻［7］方法。分別選取無全身性疾病的＜30歲和＞50歲志愿者因阻生拔除的第三磨牙各4例，拔除后立即用PBS液沖洗3遍后，刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織，切割成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，0.01 mol/L PBS液沖洗后，移入離心管內(nèi)，以1∶1比例加入3 mg/mL的I型膠原酶和4 mg/mL的Dispase的混合液2 mL，37℃培養(yǎng)箱消化15 min。然后再將組織塊以5 mm的間隔平整放于6孔板中，上置蓋玻片，滴加含100 mL/L胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)基，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，每2～3 d半量換液。待細胞從組織塊邊緣爬出并生長匯合達80%時，用2.5 g/L胰酶或1 g/L EDTA，pH=6.4消化傳代7～10 d。

1.3 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)人牙周膜干細胞

收集上述培養(yǎng)上清1500 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm直徑的小濾器過濾后，與培養(yǎng)基以1∶1比例混合作為適應性培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的第1代細胞懸液，調(diào)整細胞密度至10～15/mL，吹打混勻接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h后標記單個細胞孔，并補液至每孔200 μL，5 d換液，待克隆長至孔底1/3～1/2后2.5 g/L胰蛋白酶消化，擴大培養(yǎng)。

1.4 細胞克隆形成能力

取生長良好的第3代細胞，以1×103的密度接種于9 cm的培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，鏡下觀察培養(yǎng)皿內(nèi)克隆情況，14 d終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS浸洗2次加40 g/L多聚甲醛液固定15 min，棄去固定液，加適量甲苯胺藍染色15 min，PBS浸洗2次，以不少于50個細胞的集落計為一克隆，并按照下列公式計算克隆形成率。

1.5 MTT法檢測生長曲線

取不同年齡段人PDLSCs胰酶消化后制成細胞懸液，以1.5×103個接種于96孔板，每孔加入含100 mL/L FBS 的 α－MEM 培養(yǎng)液180 μL，37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。分別于培養(yǎng)后1、2、3、4、5、6、7 d 各取一組細胞，于每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。然后，吸去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜液，在振蕩器中震蕩10 min后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測每孔490 nm波長吸光(OD)值。實驗重復3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞表面分子

取不同年齡段第5代 PDLSCs調(diào)整至細胞密度1×106/mL，40 g/L多聚甲醛固定15 min;PBS洗滌2次，分別加入兔抗鼠 STRO－1、CD146和CD105單抗，室溫孵育60 min;洗滌后分別加入羊抗兔Ig－FITC，室溫避光45 min;流式細胞儀檢測細胞表面 CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD31、STRO－1，CD146的表達水平。

1.7 PDLSCs成脂能力鑒定

取不同年齡段第5代PDLSCs，以5×104/mL的密度接種于6孔板，細胞擴增至90%左右時，加脂肪細胞誘導液(含 1 μmol/L DEC、0.5 mmoL/L IBMX、10 rng/L BPE、100 mmoL/L Indomethacin、100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液)誘導培養(yǎng)，每3 d換液1次。培養(yǎng)14 d后，棄原液，PBS沖洗，40 g/L多聚甲醛，油紅O染色鏡下觀察。成脂分化染色后用異丙醇洗脫油紅O，在510 nm波長下測定OD值，以之作為成脂分化的定量值。

1.8 PDLSCs成骨能力鑒定

取不同年齡段第5代PDLSCs，以5×104/mL的密度接種于6孔板，待細胞擴增至60%左右時，更換礦化誘導液 (含10 mmoL/L β－甘油磷酸鈉、50 μg/mL 維生素 C、1×10－8moL/L 地塞米松、50 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)21 d。鏡下觀測到細胞聚集并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)時，棄誘導液，去離子水漂洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，茜素紅染色鏡下觀察。成骨分化染色后，洗脫茜素紅，在562 nm波長下測定OD值，并對每個培養(yǎng)孔細胞做蛋白定量，以茜素紅OD值與蛋白定量值的比值作為成骨分化的定量值。

1.9 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩獨立樣本均數(shù)比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜干細胞的分離和培養(yǎng)

本研究采用消化法培養(yǎng)原代細胞，細胞以組織塊為中心向周邊擴展，＜30歲組3～7 d均有大量細胞長出，而＞50歲組最晚，10 d才有細胞爬出組織塊;細胞相互接觸匯合成片達80%時間＜30歲組平均12 d，＞50歲組18 d。傳代后細胞大多數(shù)呈長梭形或短梭形，生長快慢不等，匯合后呈漩渦狀生長，胞體豐滿，缺乏細長突起，相當數(shù)目為三角形或是多角形，但都表現(xiàn)為胞核聚集在中心，胞質(zhì)形成的突起向外呈放射狀，具有成體干細胞的特征(圖1)。單克隆挑選培養(yǎng)14 d后，細胞克隆形成能力＜30歲組為(31.1±0.926)%，＞50歲組為(10.3±0.912)%，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(圖2)。

圖1 牙周膜干細胞原代培養(yǎng)光鏡照片(14 d，×40)

圖2 單細胞克隆培養(yǎng)光鏡照片(14 d，×20)

圖3 MTT法檢測細胞生長曲線

2.2 PDLSCs生長情況

MTT法檢測見＞50歲組細胞生長相對緩慢，與＜30歲組相比除第1天外，其他各時間點差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3)。

2.3 流式細胞分析結(jié)果

＜30歲與＞50歲組牙周膜干細胞表面分子的表達相似，均陽性表達間充質(zhì)干細胞特異性表面標記 CD29、CD44、CD90、CD105、CD146、STRO －1，陰性表達造血系細胞特異性分子CD34和內(nèi)皮細胞特異性分子CD31(圖4)。

圖4 流式細胞儀檢查結(jié)果

2.4 PDLSCs成脂、成骨能力比較

經(jīng)成脂誘導液培養(yǎng)至第10天左右，可見細胞形態(tài)發(fā)生改變，較培養(yǎng)初期更為飽滿，至14 d時油紅O染色陽性，細胞胞漿內(nèi)有脂滴形成(圖5)，成脂量化分析顯示，＜30歲組為0.898%，＞50歲組為0.398%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);成骨誘導液培養(yǎng)8 d后，細胞呈復層生長，局部增厚，12 d左右中央出現(xiàn)許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。21 d左右孔板底部出現(xiàn)肉眼可見針尖大小灰白色小結(jié)節(jié)，并逐漸增大，茜素紅染色可見紅色礦化結(jié)節(jié)(圖6)。成骨量化分析顯示 ＜30歲組為1.11%，＞50歲組為0.64%，兩組差異亦有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

圖5 體外成脂誘導光鏡照片(14 d，×100)

圖6 體外成骨誘導光鏡照片(21 d，×100)

3 討論

目前牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)基本成熟，利用自體來源干細胞治療牙周病的研究一直是熱門課題［5－8］。以往研究中，年齡因素對牙周膜干細胞性能的影響報道不多，特別是50歲以上的患牙牙周膜中是否仍然存在足夠數(shù)目的干細胞、其增殖分化能力是否與年輕牙周膜干細胞有顯著差異，尚未見報道。

本結(jié)果顯示:＞50歲病人來源的第三磨牙牙周膜中仍然存在PDLSCs，并具有基本的牙周膜干細胞特性，但與＜30歲組相比，其增殖與分化能力相對較弱。Nagatomo 等［9］(2006)發(fā)現(xiàn):PDLSCs表達 細 胞 表 面 抗 原 CD105、CD166、STRO－1。Ivanovski等［10］(2001)發(fā)現(xiàn):PDLSCs或骨髓基質(zhì)干細胞均無CD14、CD45、CD34表達。本研究發(fā)現(xiàn):＜30歲組和＞50歲組來源的PDLSCs間充質(zhì)干細胞表面標記均陽性表達，而在造血系表面標記陰性表達，但＜30歲組陽性率略低于50歲以上組(未進行統(tǒng)計學分析)。成骨、成脂能力體外誘導實驗結(jié)果表明:隨著年齡增加，人PDLSCs多向分化能力減弱，與文獻報道結(jié)果一致［11］。因此，在未來人PDLSCs的應用和轉(zhuǎn)化研究中，應充分考慮到年齡因素對干細胞性能產(chǎn)生的影響［12－13］。本研究的進一步深入探索，應擴大樣本資料，對不同年齡組來源的人PDLSCs的相關(guān)特性進行研究，并對不同組細胞的基因表達差異進行對比分析，以期獲得更有價值的數(shù)據(jù)資料。

［1］Pihlstrom BL，Michalowicz BS，Johnson NW.Periodontal disea-ses［J］.Lancet，2005，366(9499):1809 －1820.

［2］Chen FM，Jin Y.Periodontal tissue engineering and regeneration:current approaches and expanding opportunities［J］.Tissue Eng Part B Rev，2010，16(2):219 －255.

［3］Villar CC，Cochran DL.Regeneration of periodontal tissues:guided tissue regeneration［J］.Dent Clin North Am，2010，54(1):73－92.

［4］Reynolds MA，Aichelmann－Reidy ME，Branch－Mays GL.Regeneration of periodontal tissue:bone replacement grafts［J］.Dent Clin North Am，2010，54(1):55－71.

［5］Liu Y，Zheng Y，Ding G，et al.Periodontal ligament stem cellmediated treatment for periodontitis in miniature swine［J］.Stem Cells，2008，26(4):1065 －1073.

［6］Feng F，Akiyama K，Liu Y，et al.Utility of PDL progenitors for in vivo tissue regeneration:a report of 3 cases［J］.Oral Dis，2010，16(1):20 －28.

［7］Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364(9429):149 －155.

［8］Ivanovski S，Gronthos S，Shi S，et al.Stem cells in the periodontal ligament［J］.Oral Dis，2006，12(4):358 －363.

［9］Nagatomo K，Komaki M，Sekiya I，et al.Stem cell properties of human periodontal ligament cells［J］.J Periodont Res，2006，41(4):303－310.

［10］Ivanovski S，Haase HR，Bartold PM.Expression of bone matrix protein mRNAs by primary and cloned cultures of the regenerative phenotype of human periodontal fibroblasts［J］.J Dent Res，2001，80(7):1665 －1671.

［11］Zheng W，Wang S，Ma D，et al.Loss of proliferation and differentiation capacity of aged human periodontal ligament stem cells and rejuvenation by exposure to the young extrinsic environment［J］.Tissue Eng Part A，2009，15(9):2363 －2371.

［12］陳發(fā)明，金巖，施松濤，等.轉(zhuǎn)化醫(yī)學:十年回顧與展望［J］.實用口腔醫(yī)學雜志，2011，27(1):5－11.

［13］唐亮，金巖，王松靈，等.以轉(zhuǎn)化為導向的口腔醫(yī)學與干細胞研究［J］.北京大學學報:醫(yī)學版，2011，43(1):1－5.