魯 紅，田 宇，吳織芬，王小勇

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032;2.軍事科學(xué)院門(mén)診部，北京 100091)

應(yīng)用組織工程技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)真正意義上的牙周再生［1］，而選擇理想的生長(zhǎng)因子載體和組織工程支架材料則是組織工程研究需要解決的首要問(wèn)題［2］。納米羥晶/膠原仿生骨材料(nano-Hap/Collagen，nHAC)是一種新型納米羥基磷灰石材料，它仿照天然骨結(jié)構(gòu)將膠原與羥基磷灰石復(fù)合，并用聚乳酸(Poly Lactic acid，PLA)修飾，從而在納米結(jié)構(gòu)上與天然骨極為接近，具有良好的孔隙率和生物相容性［3］，如將其應(yīng)用于牙周組織再生修復(fù)應(yīng)能為牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)在缺損區(qū)的生長(zhǎng)和分化提供支架和傳導(dǎo)作用，而若與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用，則亦應(yīng)能增加對(duì)PDLCs的誘導(dǎo)分化作用?；谝陨涎芯克悸罚狙芯繑M先通過(guò)體外研究觀察nHAC的支架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相容性;再將bFGF與nHAC三維支架材料復(fù)合植入動(dòng)物人工牙周缺損區(qū)，觀察分析其對(duì)牙周組織再生修復(fù)的影響和作用，以期為牙周組織工程生長(zhǎng)因子載體和支架材料的選擇和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，并為組織工程技術(shù)在牙周病治療方面的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)(Gibco，美國(guó));胰蛋白酶(Sigma，美國(guó));nHAC(清華大學(xué)材料系研制，清華大學(xué)崔福齋教授、廖素三博士惠贈(zèng));S-520掃描電鏡(日本);rh-bFGF(寶泰克生物技術(shù)有限公司);e-PTFE膜(上海塑料研究所);組織切片機(jī)(Leitz，德國(guó));顯微鏡用測(cè)微尺(上海第三光學(xué)儀器廠);倒置顯微鏡和照相系統(tǒng)(Olympus，日本)。

1.2 HPDLCs在nHAC支架材料上附著、生長(zhǎng)情況

1.2.1 nHAC 的預(yù)處理

取橫截面直徑為5 mm的nHAC圓柱體，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要垂直于長(zhǎng)軸切割成直徑為5 mm、厚1 mm的圓片，鈷60滅菌備用。

1.2.2 HPDLCs的體外培養(yǎng)

取因正畸需要拔除的新鮮第一前磨牙，刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊，鋪于培養(yǎng)瓶底，加入含 100 mL/L FBS的α-MEM培養(yǎng)液，在飽和濕度、50 mL/L CO2、950 mL/L空氣、37℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育。待細(xì)胞匯合達(dá)瓶底80%時(shí)，2.5 g/L胰蛋白酶消化并傳代，取4～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 HPDLCs接種至 nHAC 支架

取生長(zhǎng)良好的第4代HPDLCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1000 r/min離心7 min，收集細(xì)胞，用α-MEM培養(yǎng)液漂洗2遍后重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL。然后取0.2 mL細(xì)胞懸液分別接種于3個(gè)nHAC圓片上，并經(jīng)負(fù)壓抽吸使細(xì)胞懸液充分進(jìn)入nHAC的多孔間隙后，小心將負(fù)載細(xì)胞的nHAC圓片移至24孔板中，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育。2 h后再小心加入2 mL含100 mL/L FBS的α-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h換液1次。

1.2.4 掃描電鏡觀察

培養(yǎng)72 h后，取PDLCs/nHAC三維立體培養(yǎng)標(biāo)本用30 mL/L戊二醛固定，乙腈系列脫水，真空干燥，噴金鍍膜后掃描電鏡觀察HPDLCs在nHAC支架上附著、生長(zhǎng)情況。

1.3 nHAC復(fù)合bFGF對(duì)牙周組織再生修復(fù)的影響

1.3.1 bFGF 與 nHAC 的復(fù)合

取一定量的bFGF直接溶于適量無(wú)菌蒸餾水中，然后加入一定數(shù)量的nHAC顆粒并進(jìn)行真空抽吸，以使溶液盡可能吸入材料孔隙中，經(jīng)凍干即得到復(fù)合的bFGF/nHAC，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.3.2 牙周組織缺損模型的制備和處理

取1～2歲、體質(zhì)量15～20 kg的健康雄性雜種犬6只(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，常規(guī)麻醉后，以每只犬下頜兩側(cè)第2、3、4前磨牙共36個(gè)牙為實(shí)驗(yàn)牙，翻開(kāi)齦瓣，分別在每個(gè)牙的根分叉區(qū)制備頰舌向深度約為3.5 mm，垂直向高度約為4 mm的人工牙周組織缺損區(qū)，徹底刮除暴露于根面的牙周膜和牙骨質(zhì)，并用細(xì)裂鉆在缺損區(qū)根面上作平齊于牙槽骨嵴的切跡，作為組織學(xué)觀察的標(biāo)志點(diǎn)。然后將36個(gè)牙隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單置 e-PTFE膜(單純引導(dǎo)組織再生)組和nHAC/bFGF加e-PTFE膜組。nHAC/bFGF/e-PTFE膜組植入nHAC-bFGF(經(jīng)計(jì)算，每個(gè)牙位放置的 bFGF 量約為27 μg，nHAC 量約為 2.4 g)，縫合固定e-PTFE膜，最后縫合齦瓣，上塞治劑。單置e-PTFE膜組只覆蓋e-PTFE膜，空白對(duì)照組不作任何處理直接縫合。所有動(dòng)物術(shù)后連續(xù)3 d肌注慶大霉素預(yù)防術(shù)后感染，且均進(jìn)流食。

術(shù)后6周在麻醉下行二次手術(shù)，取出兩實(shí)驗(yàn)組的e-PTFE膜，并觀察e-PTFE膜下根分叉區(qū)新生肉芽組織生長(zhǎng)情況。

1.3.3 取材和組織學(xué)觀察

術(shù)后8周處死所有動(dòng)物并取材，標(biāo)本分切，脫鈣，組織切片，常規(guī)HE染色和改良Mallory三色法染色，光鏡下觀察新生牙周組織生長(zhǎng)情況，并對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)測(cè)量。測(cè)量指標(biāo)包括:①骨缺損高度(defect height，DH):根分叉頂至根方切跡底間距離;②新生牙槽骨高度(new bone formation，NB):根方切跡底至新生牙槽骨冠方頂間距離;③新生牙骨質(zhì)高度(new cementum formation，NC):根方切跡底至新生牙骨質(zhì)冠方頂間距離;④新生結(jié)締組織附著(new connective tissue，CT):根方切跡底至根分叉頂新生結(jié)締組織附著高度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Excel 2003和SPSS 18.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，兩兩比較用SNK-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HPDLCs在nHAC上生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

掃描電鏡低倍視野下可見(jiàn)HPDLCs在nHAC上生長(zhǎng)茂密，細(xì)胞密度高(圖1);高倍視野下可見(jiàn)nHAC具有良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而HPDLCs在nHAC上生長(zhǎng)旺盛，伸展充分，貼附牢固，細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形，多圍繞孔隙或跨孔隙生長(zhǎng)(圖2)。

2.2 術(shù)后6周膜下根分叉區(qū)新生肉芽情況

術(shù)后6周取膜時(shí)，可見(jiàn)根分叉牙周缺損處已被新生肉芽組織充滿，肉芽質(zhì)地柔軟，與根面貼附緊密，無(wú)炎性滲出。

2.3 術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)部位肉眼觀察結(jié)果

各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)牙術(shù)區(qū)組織愈合良好，齦溝深度不超過(guò)1 mm，無(wú)明顯牙周炎癥，個(gè)別牙有1 mm左右的齦退縮。

2.4 組織學(xué)觀察和測(cè)量

光鏡下對(duì)動(dòng)物組織切片進(jìn)行組織學(xué)觀察可見(jiàn):nHAC/bFGF/膜組較空白對(duì)照組和單置e-PTFE膜組有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨質(zhì)樣組織生長(zhǎng)，且未見(jiàn)上皮長(zhǎng)入。新生牙槽骨幾乎充滿根分叉區(qū);其新沉積的牙骨質(zhì)從切跡底向冠方延伸，覆蓋根分叉的大部分區(qū)域;在牙周膜間隙內(nèi)有平行及斜行的類Sharpey纖維插入新生牙槽骨和新生牙骨質(zhì)(圖3)。而單置e-PTFE膜組新生組織量較nHAC/bFGF/膜組少，新生牙槽骨部分再生，未能充滿根分叉區(qū)，根分叉頂端膠原纖維大部分與牙面平行，新生牙骨質(zhì)不完全(圖4)。空白對(duì)照組新生牙周組織量更少，主要位于切跡內(nèi)，并有大量上皮長(zhǎng)入(圖5)。

各組新生牙周組織的量化比較(表1)可見(jiàn):各組 DH 無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)，而 NB、NC、CT 等指標(biāo)均以 nHAC/bFGF/膜組最高，其次為單置e-PTFE膜組，空白對(duì)照組最低。各指標(biāo)3組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。

圖2 HPDLCs伸展充分，圍繞孔隙或跨孔隙生長(zhǎng)，可見(jiàn)nHAC的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(SEM，×700)

圖3 術(shù)后8周nHAC/rh-bFGF/膜組根分叉牙周缺損處新生牙周組織幾乎充滿根分叉區(qū)，未見(jiàn)上皮長(zhǎng)入(三色法，15 ×1.3)

圖4 術(shù)后8周單置e-PTFE膜組根分叉區(qū)新生牙周組織不完全，未見(jiàn)上皮長(zhǎng)入(HE，15×1.3)

圖5 術(shù)后8周空白對(duì)照組根分叉區(qū)新生牙周組織量少，主要位于切跡內(nèi)，并有大量上皮長(zhǎng)入(HE，15 ×1.3)

表1 各組DH、NB、NC、CT等指標(biāo)比較(mm，)

表1 各組DH、NB、NC、CT等指標(biāo)比較(mm，)

不同字母組間P﹤0.05

DH NB NC CT空白對(duì)照組 12 4.26 ±0.21a 1.18 ±0.13a 1.26 ±0.10a 1.14 ±0.12組別 n a單置 e-PTFE 膜組 12 4.39 ±0.19a 2.82 ±0.18b 2.55 ±0.16b 2.65 ±0.13b nHAC/bFGF/膜組 12 4.22 ±0.17a 3.87 ±0.17c 3.82 ±0.20c 3.90 ±0.22c

3 討論

理想的組織工程載體應(yīng)滿足以下要求［4］:①良好的生物相容性;②良好的生物降解性，且其降解速率必須與植入的細(xì)胞組織形成的速率相匹配;③良好的材料-細(xì)胞作用界面，利于細(xì)胞的粘附和增殖;④具有多孔性結(jié)構(gòu)和一定的堅(jiān)韌性，能支撐一定的三維立體結(jié)構(gòu)，可提供種子細(xì)胞滲透和新生組織生長(zhǎng)繁殖的足夠空間;⑤具有良好的可塑性，可以根據(jù)需要加工成各種形狀和大小。本研究應(yīng)用的nHAC是一種納米尺寸的仿生骨材料，它在納米結(jié)構(gòu)上與天然骨極為接近，因而具有更好的孔隙率和生物相容性［5］，其孔隙率高達(dá)80% ～90%，孔徑為100～600 μm，降解速率為6個(gè)月可降解80%以上，并已有研究證實(shí)此新型仿生骨材料促進(jìn)和加快骨創(chuàng)愈合的作用明顯［3］。據(jù)此，本研究擬通過(guò)將體外培養(yǎng)的人PDLCs接種到nHAC三維支架上復(fù)合立體培養(yǎng)，使nHAC與牙周組織的主要功能細(xì)胞(PDLCs)直接接觸，觀察HPDLCs在nHAC三維支架上的生長(zhǎng)情況，以初步評(píng)價(jià)nHAC的細(xì)胞相容性和應(yīng)用于牙周組織工程的可行性。本研究中掃描電鏡觀察可見(jiàn)nHAC具有良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，人HPDLCs在nHAC上貼附緊密，伸展充分，生長(zhǎng)旺盛，提示nHAC具有良好的細(xì)胞相容性。

bFGF是一種能與肝素特異性結(jié)合的活性多肽，是中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源細(xì)胞的主要有絲分裂原和形態(tài)發(fā)生因子，具有廣泛的生物學(xué)作用［6］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)它能促進(jìn)軟骨前體細(xì)胞的分化和軟骨細(xì)胞的增殖和成熟，增加異體骨基質(zhì)誘導(dǎo)成骨量［7］。bFGF還是毛細(xì)血管增殖刺激劑，能夠促進(jìn)毛細(xì)血管向骨斷端和骨移植物中生長(zhǎng)，對(duì)成骨細(xì)胞的基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨形成［8］。有研究報(bào)道:bFGF與移植物的結(jié)合可增強(qiáng)移植物骨化，這與其促進(jìn)血管形成，激活成骨細(xì)胞的活性有關(guān)［9］，Argün等［10］觀察到bFGF與脫礦骨基質(zhì)結(jié)合后植入骨質(zhì)缺損區(qū)，能夠增加骨質(zhì)形成量，在牙周領(lǐng)域，Shirakata［11-12］等經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)將 bFGF 應(yīng)用于牙周組織缺損修復(fù)，可促進(jìn)牙周組織的再生重建。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上將bFGF與納米羥基磷灰石材料-nHAC相復(fù)合，bFGF賦予nHAC組織誘導(dǎo)活性，而nHAC則充當(dāng)bFGF的載體支架，將此復(fù)合物應(yīng)用于牙周缺損修復(fù)，為防止上皮向缺損部位長(zhǎng)入，同時(shí)結(jié)合GTR技術(shù)，結(jié)果可見(jiàn)nHAC/bFGF復(fù)合體可明顯促進(jìn)新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)和新生牙周膜的生成，與空白對(duì)照組和單置e-PTFE膜組相比，具有顯著性差異，且實(shí)驗(yàn)部位未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，從而證實(shí)bFGF與nHAC體內(nèi)復(fù)合植入可更有效地促進(jìn)牙周組織再生和重建，并進(jìn)一步證實(shí)了nHAC良好的生物相容性和作為生長(zhǎng)因子載體和牙周組織工程支架材料的應(yīng)用潛能。

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