孫文霞，袁仕善＊，黃昊文，譚云洪，黃紹文，張小萍

（1.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙410013；2.湖南科技大學化學化工學院，湖南 湘潭411201；3.湖南省結核病防治研究所，湖南 長沙410013）

結核?。═uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，目前在全球范圍內疫情非常嚴重，早期診斷和治療是有效控制TB的重要途徑。免疫學診斷是目前診斷結核病的常用方法，免疫學診斷的抗原主要有菌體蛋白、菌糖脂抗原、菌抗原模擬肽等；檢測方法主要有酶免法。該方法簡單快速，價格低廉，但需要酶標二抗和底物。表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術是一種新型高靈敏度的生物傳感技術，可直接、實時、原位、在線監(jiān)測生物分子間的相互作用，無需任何標記，樣品用量少，可連續(xù)監(jiān)測結合和解離過程，并可以進行多組分復合物的相互作用研究［1，2］。納米金生物傳感器是一種基于納米金局域表面等離子體共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）的非標記生物傳感器，這類傳感器以納米金單層作為界面固定抗原／抗體，具有非特異性吸附小、傳感器能反復再生等優(yōu)點，非常適于抗原－抗體相互作用的研究［3，4］。本研究旨在納米金生物傳感技術的基礎上，以結核分枝桿菌模擬肽為抗原，建立納米金生物傳感器，為結核病的診斷提供新的理論依據(jù)和技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

硼氫化鈉（NaBH4）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、抗 壞 血 酸 硝 酸 銀 （AgNO3）、氯 金 酸（AuCl3）均購于國藥集團化學試劑有限公司，十一巰基十一烷酸（MUA）購于美國Sigma公司，N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購于上海晶純試劑有限公司，均為分析純；結核分枝桿菌抗原模擬短肽T1由上海生工生物工程公司合成；結核患者血清由湖南省結核病防治研究所檢驗科提供，均為抗酸桿菌痰涂片陽性、血清抗結核抗體陽性的患者；正常人血清由湖南省人民醫(yī)院檢驗科提供，為健康體檢無異常者。

1.2 方法

1.2.1 結核分枝桿菌抗原模擬肽的合成 以純化的結核患者血清IgG為靶分子，從噬菌體隨機12肽庫中免疫篩選出能與結核患者血清IgG特異性結合的噬菌體，噬菌體克隆DNA經(jīng)測序分析獲得結核桿菌抗原模擬肽核酸序列，推導出其氨基酸序列為ILAMRYDTTLKY。委托上海生工生物工程公司按此序列合成模擬短肽，記為T1。

1.2.2 納米金種子溶液的制備 在室溫（20－25℃）條件下，向10ml 0.1mol／L CTAB溶液中加入0.24ml 1%AuCl3溶液，攪拌并加入5ml雙蒸水，緩慢加入冷藏的0.01mol／L NaBH4溶液，觀察溶液顏色變化：黃色→無色→淺棕色，繼續(xù)攪拌2－4 min，即得納米金種子溶液。制好的種子溶液于25℃環(huán)境中靜置2h以上備用。

1.2.3 金納米棒的制備 在室溫（20－25℃）條件下，向30ml 0.1mol／L CTAB溶液中依次加入0.8 ml 0.01mol／L AgNO3溶液和1.5ml 1%AuCl3溶液，經(jīng)攪拌溶液迅速變?yōu)榧t棕色。逐滴加入0.1 mol／L抗壞血酸溶液直至溶液剛好褪色，繼續(xù)攪拌4－5min即得納米棒的成長液。向成長液中加入70μl納米金種子溶液，繼續(xù)攪拌2min，將溶液靜置于25℃環(huán)境中，觀察顏色變化。待顏色不再變化穩(wěn)定后，用紫外可見分光光度計進行光譜掃描。掃描波長為1 100－400nm，雙蒸水調基線，觀察金納米棒的特征吸收峰：縱向等離子體吸收峰（longitudinal plasmon peak，LPP，一般由納米棒粒子的縱橫比決定）和橫向等離子體吸收峰（transverse plasmon peak，TPP）的位置，記錄為LPW和TPW。

1.2.4 金納米棒的活化 在室溫（20－25℃）條件下，取6ml金納米棒溶液，加入1.2ml 0.005mol／L MUA溶液，混勻密封，于27－30℃環(huán)境下靜置12h。14 000r／min離心10min，除去上層清液，用0.01mol／L CTAB溶液分散，搖勻。分散的金納米棒溶液中加入EDC至終濃度為75mmol／L，充分混勻。加入NHS至終濃度為15mmol／L，充分混勻。室溫下活化40min。8 000r／min離心10min，除去上層清液，用雙蒸水分散，搖勻。紫外可見分光光度計進行光譜掃描，觀察金納米棒溶液的LPW和TPW，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 金納米棒與抗原的作用 在室溫（20－25℃）條件下，每6ml活化后的金納米棒溶液加入50 μl 0.4mg／ml的合成短肽T1。將接入抗原的金納米棒溶液于25℃的恒溫箱中靜置1h，讓其充分反應。1h后將該溶液用紫外可見分光光度計進行檢測，觀察溶液的LPW和TPW，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 血清學分析 接上合成短肽T1的金納米棒溶液即為構建好的納米金生物傳感器，室溫（20－25℃）條件下，將納米金生物傳感器按2ml每份分裝。將結核病人血清樣品和正常人血清樣品用雙蒸水稀釋100倍。往分裝的2ml納米金生物傳感器中加入20μl稀釋后的血清，此時血清最終反應濃度為104倍稀釋，靜置于恒溫箱中作用2min左右。紫外可見分光光度計檢測反應后的金納米棒溶液，觀察其LPW和TPW，記錄數(shù)據(jù)，以病人／正常人紅移值（P／N）≧2.0判定為陽性，并計算敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、診斷效率。

1.2.7 儀器表征 可見近紅外光譜（Vis－NIR spectroscopy）在紫外可見分光光度計上檢測，以雙蒸水為基準，光譜掃描范圍為1100－400nm。

2 結果

2.1 金納米棒的制備

金納米棒溶液制好后，紫外可見分光光度計進行光譜掃描，圖1為其 Vis－NIR吸收光譜圖，由Vis－NIR吸收光譜圖可知，約520nm處的吸收峰為金納米棒的橫向等離子體峰TPP，730nm附近的吸收峰是縱向等離子體峰LPP。

2.2 納米金傳感器的構建

制備好的金納米棒與合成短肽結合，圖2為金納米棒修飾抗原前后的Vis－NIR吸收光譜圖。其LPW從760nm轉變?yōu)?68nm，LPP的波長位置發(fā)生了8nm的紅移?？乖揎棾晒蠹礊榭捎玫募{米金生物傳感器。

2.3 納米金生物傳感器診斷結核病

將納米金生物傳感器分別與結核病人血清、正常人血清反應，圖3為反應前后Vis－NIR吸收光譜圖。a為完成表面修飾的金納米棒，其LPW為804 nm；b為與結核病人血清作用的金納米棒，其LPW為815nm；c為與正常人血清作用的金納米棒，其LPW為807nm?？芍猅1－Au NRs檢測結核病人血清時其LPW紅移了11nm，檢測正常血清時LPW只紅移3nm。這與抗原－抗體的特異性反應 效果是一致的。

圖1 金納米棒的Vis－NIR吸收光譜圖

圖2 金納米棒表面抗原修飾前后的Vis－NIR吸收光譜圖

圖3 T1－Au NRs與血清反應的Vis－NIR吸收光譜圖

用T1－Au NRs對56份結核病人血清和56份正常人血清進行檢測，參與檢測的病人血清中，大部分反應發(fā)生了5－20nm的紅移。按P／N≧2.0判定為陽性，對病人血清的檢出率為57.1%，而對正常人血清亦有16.1%的陽性率，經(jīng)檢驗，陽性率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。計算得敏感性為57.1%，特異性為83.9%，陽性預測值為78.0%，陰性預測值為66.2%，診斷效率為70.5%。結果見圖4和表1。

圖4 T1－Au NRs的血清學分析

表1 T1－Au NRs診斷結核病

3 討論

金納米棒是一種金圓柱體的棒狀物，因其直徑大約為10－20nm，長度約為40－200nm而得名。金納米棒的合成方法很多，如模板法［5，6］、電化學法［7］和種子生長法［8－12］等。Nikoobakht等改進了種子生長法，使金納米棒的產(chǎn)率高達99%［10］。后來，Murphy等報道了一種合成不同形狀和尺寸的金納米顆粒的方法［11］。本研究在Nikoobakht種子生長法的基礎上對部分實驗參數(shù)進行了修改，制備合成了分散性好、產(chǎn)率高的金納米棒。

LSPR是一種由入射光（電磁場）與金屬納米粒子表面自由電子間相互作用產(chǎn)生的物理光學現(xiàn)象，入射光激發(fā)金屬粒子表面自由電子發(fā)生集體振蕩，當入射光頻率與自由電子集體振蕩頻率相等時達到共振，并在紫外－可見吸收光譜中表現(xiàn)出特征吸收峰［13］。這種共振頻率與電子密度、粒子大小和形狀等密切相關。對于金納米棒，因為電子在長軸和短軸方向的振蕩頻率顯然有所差異，從而表現(xiàn)出兩種不同共振頻率，即縱向和橫向表面等離子共振，在Vis－NIR圖譜上則表現(xiàn)為沿縱向長度方向激發(fā)所引起的縱向等離子體峰（LPP）和沿橫向寬度方向激發(fā)所引起的橫向等離子體峰（TPP）。已證明Vis－NIR吸收光譜圖的改變很大程度上取決于納米粒子的形狀和其所處的環(huán)境［14－17］。對金納米棒進行光學檢測，經(jīng)其吸光光譜圖發(fā)現(xiàn)，TPP的波長（TPW）隨橫向寬度的變化不太明顯，而LPP的波長（LPW）會隨著納米棒縱橫比的變化而呈較明顯的變化，即不同縱橫比的納米棒對應著不同的縱向等離子體。因此，當金納米棒上結合了活化劑等分子時，納米棒的縱橫比會發(fā)生改變，從而引起LPW發(fā)生改變，由此可以根據(jù)LPW的改變來觀察金納米棒的修飾及抗原抗體的結合作用。

Kah等［18］證明基于金納米棒的SPR技術可以對普通癌癥進行早期診斷。Sironi等［19］將抗－p53抗體結合到金納米棒，并與異硫氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）結合構建SPR傳感器，對p53的檢測濃度為200－400pmol／L。Lee等［20］將抗β3－淀粉樣蛋白（1－40）抗體包被到金納米粒子形成免疫復合物，建立的SPR傳感器成功用于β3－淀粉樣蛋白（1－40）的檢測，有利于阿爾茨海默氏癥的早期發(fā)現(xiàn)。雖然該技術已經(jīng)在多種疾病的診斷方面獲得應用，但目前其在結核病診斷中的應用還比較罕見。診斷試驗的評價指標包括靈敏度、特異性、預測值及診斷效率，理想的試驗應能使任何一個病人都表現(xiàn)出陽性結果，任何一個健康者都表現(xiàn)為陰性結果，但實際上這種理想試驗結果是不存在的。本文利用合成肽T1構建納米金生物傳感器，對112例血清樣品分別進行了血清學檢測分析，并計算了各項評價指標。結果顯示，T1－Au NRs對結核病人血清的診斷陽性率為57.1%，特異性為83.9%，對結核病有著較好的診斷價值。T1－Au NRs對正常人血清也有一定的陽性反應，但經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析比較陽性率，發(fā)現(xiàn)差異是有統(tǒng)計學意義的。納米金生物傳感器用做診斷有著簡便、快速的優(yōu)勢，檢測一個血清樣品僅需2min，且多個樣品可同時檢測，最大的優(yōu)點便在于不需要標記抗體，省去了繁瑣的洗滌步驟。

總之，本實驗對一種基于LSPR的、快速簡單且價廉的診斷結核病的新方法進行了探索研究。經(jīng)過MUA、EDC和NHS的化學修飾，我們將合成肽結合到了Au NRs上，成功獲得了T1－Au NRs，血清學分析證明T1－Au NRs對結核病有較理想的診斷價值，相信這種傳感器將會成為結核病診斷的有用技術。

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