陸怡峰, 吳 達(dá), 顧文博, 劉百戰(zhàn)

(中國上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082)

2011-11-05；

2012-02-01

陸怡峰(1983～)，男(漢)，江蘇無錫人，工程師，從事煙草及煙氣化學(xué)研究。E-mail:jzlyf0611@sina.com

吳 達(dá) (1974～)，男(漢)，河南清豐人，高級工程師，從事煙草及煙氣化學(xué)研究。E-mail:wud@sh.tobacco.com.cn

三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用法測定卷煙主流煙氣中NNK

陸怡峰, 吳 達(dá), 顧文博, 劉百戰(zhàn)

(中國上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082)

為了測定卷煙主流煙氣中4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的含量，建立了三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS/MS)測定方法。按照標(biāo)準(zhǔn)條件抽吸卷煙，捕集在劍橋?yàn)V片上的卷煙煙氣粒相物用二氯甲烷萃取并以氘代NNK為內(nèi)標(biāo)，經(jīng)固相萃取凈化后，用三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀測定卷煙煙氣中NNK的含量。方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～2.7%(n=6)、回收率為98.9%～116.8%、定量下限為0.087 ng/cig，完全可以滿足日常檢測的要求。本方法采用商品化固相萃取柱，避免了樣品濃縮、轉(zhuǎn)移等操作步驟，節(jié)省試劑并且提高了工作效率。應(yīng)用本方法對2R4F和其他不同類型的卷煙樣品煙氣中NNK進(jìn)行了檢測，檢測數(shù)據(jù)與國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 23228-2008(GC-TEA)一致性好，驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。

三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS/MS)；4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)；煙草特有亞硝胺(TSNAs)；卷煙煙氣

煙草特有亞硝胺(TSNAs)是卷煙煙氣中誘發(fā)癌癥的主要活性成分之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿(NAT)等4種[1]。其中NNK于1977年由Hecht等[2]首次在卷煙煙氣中發(fā)現(xiàn)。Hoffmann等[3]在1981年對敘利亞金色倉鼠進(jìn)行了皮下注射研究后認(rèn)為NNK對哺乳動(dòng)物有較強(qiáng)的致癌作用，且其致癌性在已發(fā)現(xiàn)的4種煙草特有N-亞硝胺中最強(qiáng)。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)根據(jù)一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，有充分的證據(jù)確定NNK是人體致癌物，并確定其致癌性等級(IARC Group 1)。隨著人們對吸煙與健康問題的關(guān)注，卷煙產(chǎn)品的安全、衛(wèi)生越來越得到各方面的重視，因此準(zhǔn)確測定卷煙煙氣中NNK的含量具有重要的意義。

由于卷煙煙氣中的煙草特有亞硝胺含量極微，一般濃度均在ng/cig數(shù)量級，卷煙煙氣又是非常復(fù)雜的混合物，因此卷煙煙氣中的煙草特有N-亞硝胺的定量分析有相當(dāng)?shù)碾y度。目前，檢測卷煙煙氣中TSNAs的分析方法主要有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)[5]和液相色譜-多級質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[6]等。TEA是專一性的檢測器，只對亞硝胺和亞硝酸脂響應(yīng)，對于TSNAs具有很好的選擇性。但是目前的新型號的熱能分析儀由于硬件發(fā)生了較大的改變，反而其靈敏度較以前的型號大幅度降低，測定較低含量的TSNAs存在較大的困難，不能完全滿足對于烤煙型卷煙的檢測需要；GC/MS一般只適用于TSNAs含量很高的卷煙煙氣樣品；LC-MS/MS靈敏度高，是現(xiàn)在國內(nèi)外檢測TSNAs的一種主要方法，國內(nèi)也正在制定LC-MS/MS測定主流煙氣中TSNAs的標(biāo)準(zhǔn)。

隨著近些年來分析儀器的飛速發(fā)展，其它的一些檢測方法也在煙草和煙氣中N-亞硝胺的分析上得到了應(yīng)用，特別是三重四極桿質(zhì)譜儀因其具有較高的靈敏度，可大大簡化卷煙煙氣樣品的前處理過程，而且它比單極四極桿氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀對于特征碎片離子具有更強(qiáng)的選擇性，可極大的降低背景干擾，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。現(xiàn)NNK已被國內(nèi)煙草行業(yè)列為7種主要有害成分之一重點(diǎn)監(jiān)控，每年有大量的卷煙煙氣中NNK的檢測任務(wù)。本研究采用三重四極桿氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀測定卷煙煙氣總粒相物中的NNK含量，方法的重復(fù)性、回收率和檢測限均令人滿意，且對2R4F和其他不同類型的卷煙樣品煙氣中NNK進(jìn)行檢測，以提高測試效率、檢測數(shù)據(jù)與GC-TEA法的一致性、驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性。

1 試驗(yàn)部分

1.1主要儀器與裝置

三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有7000B型三重四極桿質(zhì)譜儀和7890A型氣相色譜儀；自動(dòng)固相萃取儀：法國Gilson公司產(chǎn)品；電子天平(感量0.1 mg)：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；機(jī)械振蕩器：上?？德茧娮涌萍加邢薰井a(chǎn)品；堿性氧化鋁固相萃取柱(500 mg填料，3 mL裝)：美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.2主要材料與試劑

1.2.1材料 參比卷煙3個(gè)(2R4F，烤煙型卷煙參比，混合型卷煙參比)；市售卷煙10個(gè)。

1.2.2試劑與標(biāo)樣 二氯甲烷(色譜純)：美國 Dikma公司產(chǎn)品；無水甲醇(分析純)：國藥試劑；4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)(純度≥98%)：百靈威化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氘代4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(D4-NNK)(純度≥98%)：百靈威化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3內(nèi)標(biāo)法校正曲線的制作

NNK標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用二氯甲烷作溶劑，配制濃度為1 000 μg/L NNK標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

萃取液：配制內(nèi)標(biāo)(D4-NNK)濃度為20 μg/L二氯甲烷萃取液。

將1 mL、500 μL、200 μL、100 μL、40 μL、20 μL、10 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別準(zhǔn)確移取至20 mL萃取液(含內(nèi)標(biāo))中，稀釋混勻，用該系列溶液制作內(nèi)標(biāo)法校正曲線。

1.4樣品前處理

按照ISO4387：2 000的規(guī)定捕集20支卷煙的主流煙氣總粒相物，將捕集有主流煙氣總粒相物的劍橋?yàn)V片放入250 mL錐形瓶中，加入20 mL萃取液(含內(nèi)標(biāo))，振蕩萃取40 min，用3 mL二氯甲烷活化堿性氧化鋁固相萃取柱，取3 mL萃取溶液上樣，用2 mL二氯甲烷淋洗固相萃取柱，再用3 mLV(甲醇)∶V(二氯甲烷)=8∶92的溶液洗脫，收集此部分洗脫液進(jìn)樣分析。固相萃取柱淋洗與洗脫速率均為1 mL/min。

1.5儀器條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：VF-200 ms (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至190 ℃，以3 ℃/min升至220 ℃，保持2 min；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口、傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度280 ℃；載氣：氦氣，恒定流速1.2 mL/min；溶劑延時(shí)：8 min。

1.5.2質(zhì)譜條件 電離方式：EI-MRM；離子能：70 eV；燈電流：35 mA。碰撞氣流量：氮?dú)? mL/min；抑制氣流量：氦氣2.25 mL/min。定性、定量離子的選擇和碰撞能列于表1。

表1 NNK, D4-NNK定性, 定量離子的選擇和碰撞能

2 結(jié)果與討論

2.1凈化條件的優(yōu)化

煙氣萃取液的凈化是NNK分析非常關(guān)鍵的步驟，NNK是有機(jī)弱堿，通常采用的凈化層析填料為堿性氧化鋁，洗脫溶劑為V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=8∶92的溶液[4]。由于烤煙型和混合型卷煙煙氣中NNK含量差別很大，所以選取烤煙型和混合型卷煙各一個(gè)樣品，逐步對樣品凈化過程進(jìn)行比較試驗(yàn)，確保方法的適用性。堿性氧化鋁固相萃取柱經(jīng)二氯甲烷活化、上樣后，用2 mL二氯甲烷淋洗，收集此部分淋洗液進(jìn)樣分析；再用5 mLV(甲醇)∶V(二氯甲烷)=8∶92的溶液進(jìn)行洗脫，分5次洗脫，每次收集1 mL的洗脫液進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，烤煙型和混合型卷煙的淋洗液均未檢出NNK，故確定在樣品中NNK不損失的前提下，可采用2 mL二氯甲烷淋洗固相萃取柱，去除保留在固相萃取柱上的一部分雜質(zhì)；加入洗脫劑后，二種類型卷煙中的NNK均集中在前3 mL洗脫液中，最后2 mL洗脫液均未檢出含有NNK，故采用3 mLV(甲醇)∶V(二氯甲烷)=8∶92的溶液作為洗脫劑可以滿足檢測的需要。

2.2色譜柱的選擇

比較了VF-200 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，HP-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)兩種不同固定相色譜柱上NNK的峰型及與雜質(zhì)峰的分離效果。如圖1、圖2所示，NNK在VF-200ms色譜柱上峰型對稱性好，無明顯拖尾，且與雜質(zhì)峰的分離效果好，避免了樣品基質(zhì)干擾，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 NNK標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of NNK standard solution

圖2 4.8 ng/cig NNK卷煙主流煙氣MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of 4.8 ng/cig NNK smoking sample

2.3二級質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將10 μg/L的NNK、D4-NNK通過全掃描模式選擇出適當(dāng)?shù)哪鸽x子，再使用GC-MS/MS多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式，對選擇的母離子進(jìn)行二次質(zhì)譜分析，通過碰撞池使母離子裂解產(chǎn)生子離子，并對它們各自的碰撞能量電壓進(jìn)行優(yōu)化選擇，如圖3所示，挑選出一對母離子/子離子作為定性離子對，一對母離子/子離子作為定量離子對，得到NNK的二級質(zhì)譜條件。

2.4定量校正曲線

5級校正溶液分析后，建立了內(nèi)標(biāo)法校正曲線，如圖4所示。在0.5～200 μg/L的范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8。上述濃度范圍相當(dāng)于NNK含量0.5～200 ng/cig。

2.5檢測方法的檢出限和定量限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液最低濃度(0.5 μg/L)連續(xù)進(jìn)樣10次，測定其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限，以10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限，確定NNK的檢出限為0.026 ng/cig、定量下限為0.087 ng/cig?？緹熜途頍煙煔釴NK含量一般在1～10 ng/cig，混合型卷煙煙氣NNK含量則更高，所以本方法幾乎可以滿足所有卷煙樣品的分析測定。

圖3 D4-NNK、NNK子離子模式質(zhì)譜圖Fig.3 Product ion chromatograms of NNK and D4-NNK

圖4 NNK內(nèi)標(biāo)法校正曲線Fig.4 Linear relationship for determination of NNK

2.6檢測方法的重復(fù)性和回收率

選取烤煙型(平均含量3.78 ng/cig)、混合型(平均含量56.9 ng/cig)卷煙各一個(gè)樣品，同時(shí)測定6次，計(jì)算測定方法的重復(fù)性，二種類型卷煙的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.7%與2.3%，方法重復(fù)性良好。

將不同濃度的NNK標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白劍橋?yàn)V片，計(jì)算測定方法的空白加標(biāo)回收率，試驗(yàn)結(jié)果列于表2，空白加標(biāo)回收率為98.8%～101.1%，方法的空白加標(biāo)回收率良好。

表2 方法回收率

選取烤煙型、混合型卷煙各一個(gè)樣品，以其實(shí)際NNK含量的50%、100%、200%加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算測定方法的樣品加標(biāo)回收率，試驗(yàn)結(jié)果列于表3，二種類型卷煙的樣品加標(biāo)回收率分別為100.0%～109.0%與100.5%～116.8%，方法的樣品加標(biāo)回收率良好。

表3 樣品加標(biāo)回收率

2.7檢測方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的比對試驗(yàn)

選取不同類型的卷煙樣品13個(gè)，將本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 23228—2008(GC-TEA)測定比較卷煙主流煙氣中NNK的含量，試驗(yàn)結(jié)果列于表4，本方法檢測數(shù)據(jù)與國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 23228—2008(GC-TEA)一致性好，驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。

表4 比對數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本研究采用三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀測定卷煙主流煙氣中的NNK。以含內(nèi)標(biāo)(D4-NNK)的二氯甲烷溶液為萃取溶劑，經(jīng)過堿性氧化鋁固相萃取柱凈化，有效降低了基體效應(yīng)對分析結(jié)果的影響，方法的重復(fù)性、回收率和檢測限均令人滿意，檢測數(shù)據(jù)與國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 23228—2008(GC-TEA)一致性好，驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。本方法具有操作簡便、有機(jī)試劑用量少、環(huán)境友好等特點(diǎn)，是對國家標(biāo)準(zhǔn)方法的良好補(bǔ)充。

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DeterminationofNNKinMainstreamCigaretteSmokebyGasChromatography-TandemQuadrupoleMassSpectrometry

LU Yi-feng, WU Da, GU Wen-bo, LIU Bai-zhan

(ShanghaiTobaccoGroupCo.Ltd.,Shanghai200082,China)

A simple, sensitive and robust method for determination of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) in mainstream cigarette smoke by gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (GC-MS/MS) was developed. Four kinds of tobacco specific nitrosamines (TSNAs) exist in cigarette smoke, NNK is considered as one of the most harmful compounds in cigarette smoke. Determination of NNK in mainstream cigarette smoke is a challenging task to analytical chemists . GC-TEA method for the determination of NNK was often involved with complex clean-up steps. In this paper, the mainstream cigarette smoke collected on Cambridge pad was extracted by dichloromethame and the extra was cleaned up by basic alumina Solid column cartridge then analysed by GC-MS/MS. The reproducibility, recovery and detection limit of the method were desirable. The method was suitable for the determination of NNK in mainstream cigarette smoke. Column packing and concentration work are omitted in the total sample process. The use of deuterated internal standard simplifies the calibration work and brings a more accurate result. A comparison experiment with GC-TEA and the recovery experiment demonstrate the accuracy of this method.

gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (GC-MS/MS); 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK); tobacco specific nitrosamines (TSNAs); mainstream cigarette smoke

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0118-05