吳寧鵬，班付國，彭 麗，周紅霞，劉占通，劉宏偉

(河南省獸藥監(jiān)察所，河南 鄭州 450008)

2011-09-02；

2012-02-23

吳寧鵬(1974～)，男(漢族)，獸醫(yī)師，從事獸藥飼料檢測工作。E-mail：wnppeking2002@163.com

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法篩查飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物

吳寧鵬，班付國，彭 麗，周紅霞，劉占通，劉宏偉

(河南省獸藥監(jiān)察所，河南 鄭州 450008)

為了快速篩查未知飼料樣品中的鎮(zhèn)靜劑類藥物，應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜建立了篩查飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的方法。在不同添加濃度下獲得了精確的分子離子質(zhì)量，質(zhì)量偏差的絕對值低于3×10-6。11種鎮(zhèn)靜劑類藥物在0.02～1 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.99，添加濃度為0.5～5 mg/kg時，其添加回收率在50%～120%之間，在飼料基質(zhì)中的檢測限為0.1 mg/kg。該方法簡便、高效、準(zhǔn)確，適于飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的分析檢測需求。

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜； 鎮(zhèn)靜劑類藥物； 篩查； 飼料

鎮(zhèn)靜劑類藥物(sedatives)是指對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，從而減輕或消除動物狂躁不安癥狀，或令其恢復(fù)安靜的一類藥物，主要用于興奮不安或具有攻擊性行為的動物或患畜，以使其安靜，便于工作或治療[1]。隨著鎮(zhèn)靜劑類藥物在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用，近年來，一些不法飼料生產(chǎn)企業(yè)因經(jīng)濟利益的驅(qū)使，擅自在畜禽飼養(yǎng)過程中添加此類藥物以起到鎮(zhèn)靜催眠、增重催肥、縮短出欄時間的作用；另外，在動物運輸過程中，為減少動物死亡和體重下降，防止肉品質(zhì)降低，也常使用此類藥物以減少應(yīng)激帶來的損失。但非法使用此類藥物會使其原形和代謝產(chǎn)物不可避免地殘留于動物源食品中，人們食用了這些食品后會對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)等造成不良影響，因此許多國家都將此類藥物列為禁用藥物，我國也規(guī)定鎮(zhèn)靜劑類藥物不允許在飼料中添加使用。但由于鎮(zhèn)靜劑類藥物品種較多，我國飼料生產(chǎn)企業(yè)眾多，很難掌握在生產(chǎn)飼料時添加藥物情況，因此開發(fā)篩查飼料中鎮(zhèn)靜劑藥物的方法尤為重要。

目前，對鎮(zhèn)靜劑類藥物的檢測方法有HPLC[2-4]、GC/MS[5]、LC-MS/MS[6-12]法。由于飼料中非法添加藥物的復(fù)雜性，快速篩查飼料中的違禁藥物已經(jīng)成為研究的熱點。隨著液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(LC-TOF、LC-QTOF)技術(shù)的日趨成熟和推廣應(yīng)用，利用飛行時間質(zhì)譜測定精確質(zhì)量，實現(xiàn)對未知飼料樣品中的藥物篩查檢測已經(jīng)成為可能。質(zhì)量測定的精確度越高，理論上越可以減少可能的目標(biāo)化合物數(shù)量，從而增強對非法添加藥物確認(rèn)的可信度。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF)技術(shù)，建立了飼料中鎮(zhèn)靜劑類藥物的快速篩查檢測方法。

1 材料和方法

1.1儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源；分析天平(感量0.01 mg)： 瑞士Mettle公司產(chǎn)品。

1.2試劑

氯丙嗪、阿扎哌隆、賽拉嗪、地西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、硝基安定、奮乃靜、氟哌啶、氟哌啶醇、異丙嗪等標(biāo)準(zhǔn)品(含量均大于98%)：購自百靈威公司；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3對照溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的氯丙嗪、阿扎哌隆、賽拉嗪、地西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、硝基安定、奮乃靜、氟哌啶、氟哌啶醇、異丙嗪標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈分別將其稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4試驗方法

1.4.1色譜條件 色譜柱：C18(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)； 流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；樣度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓3.00 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度110 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣流速650 L/h；錐孔反吹氣流速50 L/h；質(zhì)量掃描范圍m/z80～1 000；亮氨酸腦啡肽實時在線分子質(zhì)量校正，相對分子質(zhì)量556.277 1，流速0.2 mL/min。

1.4.3樣品前處理 稱取2 g飼料，加入1 mL飽和乙酸鉛和9 mL 0.1%V(甲酸)∶V(甲醇)=3∶7的溶液，渦旋1 min，超聲10 min，以8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜后，上機測定。選取空白飼料，通過添加已知含量的鎮(zhèn)靜劑類藥物制備陽性樣品進(jìn)行添加回收試驗。測定數(shù)據(jù)用Waters公司的藥物篩查軟件MassLynx V 4.1進(jìn)行分析。

1.4.4實際樣品檢測 對從市場上抽檢的60份飼料樣品進(jìn)行篩查檢測，未檢出陽性樣品。

2 實驗結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率

按照上述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，飼料基質(zhì)中11種藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)列于表2，回收率及精密度列于表3。從表2、3可以看出，各藥物在0.02～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

2.2藥物篩查結(jié)果

優(yōu)化錐孔電壓，以獲得最大的分子離子豐度，測得藥物的精確分子質(zhì)量與實際分子質(zhì)量的偏差絕對值均小于3×10-6，數(shù)據(jù)列于表4。

2.3質(zhì)量準(zhǔn)確度的測定

11種鎮(zhèn)靜劑類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖示于圖1。在本研究選定的條件下，應(yīng)用高精度的質(zhì)量提取可以獲得良好的提取離子色譜圖，示于圖2。根據(jù)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，經(jīng)Waters公司MassLynx V 4.1軟件匹配元素組成示于圖3。

表2 飼料基質(zhì)溶液中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 The linear equation andcorrelation coefficients of 11 sedatives in feedstuff

表3 飼料基質(zhì)溶液中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的回收率及精密度

注：*為添加濃度，單位為mg/kg

圖1 飼料基質(zhì)中添加0.1 mg/kg鎮(zhèn)靜劑類藥物的總離子流圖 Fig.1 Total ion current chromatogram of a feed spiked with standards at 0.1 mg/kg for each sedative

表4 飼料基質(zhì)中測得的11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的精確質(zhì)量數(shù)及相關(guān)數(shù)據(jù)

圖2 飼料基質(zhì)中氯丙嗪的提取離子色譜圖 Fig.2 Extracted ion current chromatogram of chlorpromazine in feed

2.4實際樣品篩查

對從市場上抽檢的60份飼料樣品進(jìn)行篩查，其中有兩份為可疑陽性樣品，經(jīng)LC-MS/MS確認(rèn)后，均為陰性樣品。

3 討論

3.1儀器條件的優(yōu)化

對質(zhì)譜的各種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的靈敏度。錐孔電壓是影響分子離子峰的關(guān)鍵參數(shù)，分別對20～40 V錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化，在固定碰撞電壓的條件下，實驗得出在30 V的錐孔電壓下，各藥物的分子離子峰為最高。

3.2質(zhì)量測定的準(zhǔn)確度

在飼料樣品中添加0.1 mg/kg濃度下，各藥物的提取離子仍能得到一張很干凈的圖譜，各種藥物測得的精確分子質(zhì)量與實際精確分子質(zhì)量的差值都小于3×10-6，說明該方法在飼料基質(zhì)中獲得的質(zhì)量精度仍較高。通過軟件設(shè)定的質(zhì)量偏差和元素組成的種類及數(shù)量，可以直接獲得可能的分子式組成，而分子離子的精確質(zhì)量可以有效地減少可能的分子式組成數(shù)，提高對未知物篩查的效率。

3.3目標(biāo)化合物的確證

本研究根據(jù)保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、元素組成和i-FIT值，即可完成對未知鎮(zhèn)靜劑的確證分析。氯丙嗪的精確分子質(zhì)量為319.103 6，測定的分子質(zhì)量為319.104 3，經(jīng)軟件分析后，元素組成與氯丙嗪的元素組成一致，其i-FIT為最小。同位素峰的存在能進(jìn)一步確證篩查結(jié)果，圖3中有明顯的氯丙嗪同位素峰，其中m/z319.104 3(100%)，m/z321.101 1(33.6%)的質(zhì)量數(shù)相差為2，豐度比為3:1，符合化合物中含有1個氯原子的規(guī)律。另外，由于本方法是一個開放的體系，可以增加目標(biāo)化合物的分子式和保留時間的數(shù)據(jù)庫，一次進(jìn)樣，即可完成所有化合物的篩查。篩查出的陽性樣品再經(jīng)LC-MS/MS確證。

圖3 應(yīng)用Waters公司軟件匹配飼料基質(zhì)中氯丙嗪的元素組成 Fig.3 Elemental composition of chlorpromazine in feed by Waters Company software

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，UPLC-QTOF是篩查飼料中鎮(zhèn)靜劑類藥物的有效手段，測定質(zhì)量精確度多數(shù)優(yōu)于3×10-6，因此能夠滿足篩查的準(zhǔn)確性要求。此外，還具有良好的選擇性和靈敏性，不僅可以用于飼料的篩查檢測，還可以擴展到畜產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留、獸藥制劑中非法添加物等的篩查檢測。篩查檢測中的陽性結(jié)果可以通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行進(jìn)一步的確證和定量分析。隨著人們對食品安全關(guān)注度的增加，對畜產(chǎn)品以及飼料、獸藥等投入品中的有毒有害物質(zhì)篩查也會越來越重視。UPLC-QTOF能夠提供精確分子質(zhì)量，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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ScreeningMethodfor11SedativesinFeedstuffbyUltraPerformanceLiquidChromatography-QuadrupoleTime-of-FlightMassSpectrometry

WU Ning-peng, BAN Fu-guo, PENG Li, ZHOU Hong-xia, LIU Zhan-tong, LIU Hong-wei

(He’nanInstituteofVeterinaryDrugControl,Zhengzhou450008，China)

A method based on ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF) was developed for quantitative analysis of 11 sedatives in feedstuff. The accurate mass was obtained in different spiking levels (from 0.5 to 5 mg/kg)and the accuracy error was lower than 3×10-6, which was well within the accepted limits for target confirmation. The linearity of response ranges from 0.02 to 1.0 mg/L， and the correlation coefficient is greater than 0.99. The average recoveries range from 50% to 120% of the fortified 11 sedatives in feedstuff at 0.5—5 mg/kg levels. and the limits of detection are 0.1 mg/kg. The results indicate that the method is easy, fasty, and sensitive. This method can meet the requirements for simultaneous determination of 11 sedatives in feedstuff.

ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF); sedatives; screening; feedstuff

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0094-05