周莉莉，楊士斌，劉志強, 張 卉，胡 梅，祝建華

(1.中國科學院長春應用化學研究所,長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，山東 濟南 250100；3.中國航天科工集團731醫(yī)院，北京 100074)

2011-09-21；

2011-12-14

國家自然科學基金(20173057)和中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KGCX2-SW-213-06)資助

周莉莉(1981～)，女(漢)，江蘇鹽城人，博士，從事天然產(chǎn)物化學與有機質(zhì)譜學研究。E-mail:zll811128@126.com

劉志強(1962～),男 (漢)，吉林長春人，研究員,從事天然藥物化學與有機質(zhì)譜學研究。E-mail:liuzq@ciac.jl.cn

山茱萸與熟地配伍時山茱萸中主要組分變化規(guī)律研究

周莉莉1,2，楊士斌3，劉志強1, 張 卉2，胡 梅2，祝建華2

(1.中國科學院長春應用化學研究所,長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，山東 濟南 250100；3.中國航天科工集團731醫(yī)院，北京 100074)

為了研究山茱萸與熟地兩種藥物不同比例配伍時山茱萸中主要組分的變化規(guī)律，利用高效液相色譜(HPLC)法和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)法比較山茱萸和熟地藥材單煎液、合煎液和單煎合并液中山茱萸主要組分的含量變化和各溶液的譜學行為。在一定質(zhì)量比例內(nèi)(m(山茱萸)∶m(熟地)≤4∶8)，山茱萸與熟地共煎有相互協(xié)同溶出的效應。合煎液中山茱萸莫諾苷、馬錢苷和沒食子酸組分的百分含量隨熟地配伍比例的增加均呈現(xiàn)線性變化規(guī)律。不同的配伍方式(合煎與單煎合并)會產(chǎn)生不同的新物質(zhì)。結(jié)果表明，熟地組分的存在對山茱萸組分的溶出有較大影響，但該影響不受溫度的限制。

山茱萸；熟地；配伍；高效液相色譜；電噴霧質(zhì)譜

中藥山茱萸為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSeib et Zucc．除去種子的干燥成熟果肉，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補益肝腎、澀精固脫等功效[1]。莫諾苷、馬錢苷等環(huán)烯醚萜苷類化合物是山茱萸中主要的水溶性組分，生物免疫抑制活性很強[2-4]。沒食子酸是山茱萸水溶液中主要的收澀抗炎組分，大量的研究已證實沒食子酸具有抗腫瘤、殺錐蟲、抗病毒和收縮血管[5]等生物學作用，安全性好[6]。

山茱萸、熟地藥對見于《小兒藥證直決》地黃丸、《金匱要略》腎氣丸、《醫(yī)學衷中參西錄》滋膵飲等方。山茱萸固澀氣陰，平補肝腎，性平和；熟地黃善補精血，益肝腎，性滋膩。熟地黃有止血功能，可增山茱萸固崩止血之力；熟地黃得山茱萸平補之助，滋養(yǎng)肝腎之力更強。二藥配伍，互補互使，養(yǎng)血補精、止血澀精功力增加。用量山茱萸6～15 g，熟地黃9～30 g，經(jīng)典配伍質(zhì)量比例為m(山茱萸)∶m(熟地)=4∶8。趙進喜[7]針對糖尿病、腎病皆有腎虛、精微不固病機,經(jīng)常選用二藥,補腎固腎,對于腎虛精微不固所致的腰膝酸痛、尿頻量多、眩暈耳鳴、自汗盜汗、陽萎遺精等癥收效顯著。但目前還沒有對這組藥配伍的化學研究報道。

本實驗以不同方式、不同比例的山茱萸熟地配伍，通過溶出率、高效液相色譜(HPLC)、電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)等分析手段研究藥材單煎、合煎和單煎合并過程中的溶出行為，從不同角度闡明山茱萸熟地配伍時，山茱萸中主要組分的變化規(guī)律和兩藥材間的明顯相互作用。

1 實驗部分

1.1儀器和設備

1.2試劑與材料

乙腈、甲醇、醋酸(色譜純)：美國Fisher公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純：北京化工廠產(chǎn)品；水為超純水(18.2 MΩ·cm)；0.45 μm濾膜：美國Agilent公司產(chǎn)品。

山茱萸(CornusofficinalisSeib et Zucc．)，熟地(RadixRehmanniaePreparata)：購自同仁堂，由長春中醫(yī)藥大學王淑敏教授鑒定。莫諾苷、馬錢苷、沒食子酸標準品：購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3實驗方法

1.3.1樣品液的制備 單味中藥山茱萸與熟地分別用水單煎；山茱萸與熟地按4∶1，4∶2，4∶4，4∶8，4∶12的質(zhì)量比合煎；單煎液按經(jīng)典比例合并。1)單煎：稱取一定量的山茱萸和熟地，各自稱取煎煮前的質(zhì)量，并分別用紗布包扎，放入燒杯中，加入250 mL蒸餾水熱浸30 min,急火燒開后保持微沸并計時，煎煮2次，每次45 min,合并濾液，減壓濃縮并定容，得山茱萸與熟地的單煎液。所得藥渣于40 ℃下烘干至恒重，并稱取煎煮后的質(zhì)量。2)合煎：將按質(zhì)量比準確稱得的山茱萸和熟地包在同一塊紗布中，按單煎的條件同樣煎得合煎液。藥渣分離后，分別于40 ℃下烘干至恒重，并分別稱得煎煮后的質(zhì)量。3)單煎合并：分別取山茱萸單煎液和熟地單煎液，按生藥量濃度相等換算，按山茱萸熟地質(zhì)量比4∶8配得單煎合并液。

1.3.2質(zhì)譜條件 質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500，噴霧電壓5 kV，殼氣為氮氣，殼氣壓6 MPa，金屬毛細管溫度250 ℃，電壓10 V，質(zhì)譜檢測采用負離子模式。

1.3.3色譜條件 色譜柱：Capcell Pak C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；莫諾苷、馬錢苷測定：V(乙腈)∶V(水)=15∶85的混合溶液，檢測波長240 nm；沒食子酸測定：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(0.3%醋酸)=5∶6∶89的混合溶液,檢測波長270 nm；流速0.7 mL/min；柱溫35 ℃。山茱萸與熟地共煎液樣品色譜圖示于圖1。

目前，常用的浮選方案主要有兩種：浮選機分選和浮選柱分選工藝。考慮到公司選煤廠空間狹窄，旋流微泡浮選柱設備占地面積小，無運動部件，磨損小，維護工作量小，維護費用低，操作簡單，調(diào)整容易，并且精煤灰分調(diào)整幅度大，可根據(jù)煤質(zhì)和市場生產(chǎn)灰分不同的精煤等因素，決定采用FCMC-4500型旋流微泡浮選柱工藝。

1.4方法學考察

1.4.1線性關(guān)系考察 分別取2、4、6、8、10 μL 3種標準品溶液進樣，以標準品含量(x)對相應峰面積積分值(y)進行回歸，得回歸方程和線性范圍。

莫諾苷：y=2.08×106x+1.35×104,r=0.999 7,線性范圍0.4～2.02 μg。

圖1 山茱萸與熟地共煎液樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the decoction of Fructus Corni with Radix Rehmanniae Prepatrata

馬錢苷:y=4.25×106x+3.36×104,r=0.999 6,線性范圍0.52～2.60 μg。

沒食子酸:y=5.84×106x+2.36×104,r=0.999 9,線性范圍0.112～0.56 μg。

1.4.2精密度實驗 取同一份樣品液，連續(xù)進樣5次，3個色譜峰保留時間RSD分別為0.15%、0.14%、0.18%,峰面積RSD分別為0.25%、0.23%、0.28%。

1.4.3穩(wěn)定性實驗 取同一份樣品液，每隔4 h進樣1次，共測定5次，3個色譜峰保留時間RSD分別為0.52%、0.46%、0.58%,峰面積RSD分別為0.84%、0.94%、1.07%。

1.4.4重現(xiàn)性實驗 將山茱萸和熟地單煎液按質(zhì)量比4∶8合并，得到5份單煎合并液。分別按1.3方法進樣分析，3個色譜峰保留時間RSD分別為1.58%、1.25%、1.97%,峰面積RSD分別為1.92%、1.80%、1.61%。

1.4.5加標回收率實驗 精密稱取5份適量樣品，分別加入一定量的莫諾苷、馬錢苷和沒食子酸標準品，按樣品分析方法進行處理，并各平行測定2次。3種成分的平均加標回收率分別為

99.98%、100.57%、100.24%，RSD分別為2.84%、2.36%、2.74%。

2 結(jié)果與分析

2.1協(xié)同溶出效應

山茱萸和熟地單煎、合煎前后質(zhì)量變化及溶出率，列于表1，數(shù)據(jù)均為3次重復實驗的平均值，相對標準偏差(n=3)在0.7%～3.0%之間?？梢钥闯觯簩ι杰镙嵌?，山茱萸單煎時其溶出率為67.61%，山茱萸與熟地配伍時，除過大質(zhì)量比(4∶12)外，合煎后山茱萸的溶出率都比單煎時增加，但隨著熟地比例的增加，山茱萸溶出率呈線性下降，合煎質(zhì)量比為4∶8時，與單煎的溶出率相近；對熟地而言，合煎比例較小時，合煎后熟地的溶出率比單煎時增加，合煎比例過大時，則反之。分析原因可能是，熟地中含有大量寡糖，合煎比例過高后煎液粘度過大，抑制了溶出程度。溶出實驗結(jié)果表明，在一定質(zhì)量比例內(nèi)(m(山茱萸)∶m(熟地)≤4∶8)，山茱萸與熟地可相互促進組分在水中的溶出，有相互協(xié)同溶出的效應，說明山茱萸和熟地間存在相互作用。

表1 山茱萸與熟地溶出率結(jié)果

2.2樣品含量測定

按1.3方法操作，進樣10 μL，測定山茱萸與熟地不同配伍比例各樣品中莫諾苷、馬錢苷和沒食子酸的含量，結(jié)果列于表2。從表2可知，熟地中不含有這3種組分，測定結(jié)果數(shù)據(jù)均來源于山茱萸中成分。山茱萸中這3種組分的百分含量和配伍比例之間的關(guān)系示于圖2。 從表2和圖2可以看出：1)合煎液山茱萸中莫諾苷和馬錢苷組分的百分含量隨熟地配伍比例的增加呈線性增大，但均低于山茱萸單煎液；沒食子酸含量變化趨勢則相反，合煎液山茱萸中沒食子酸組分的百分含量隨熟地配伍比例的增加呈線性下降，但均高于山茱萸單煎液；2)按經(jīng)典配伍比例配制的m(山茱萸)∶m(熟地)=4∶8單煎合并溶液中，莫諾苷、馬錢苷的含量低于同樣質(zhì)量比例的合煎液，沒食子酸的含量高于同樣質(zhì)量比例的合煎液，這與這3種組分百分含量在不同配伍比例時的變化趨勢吻合。這兩點均表明，熟地對山茱萸中各有效組分的溶出均有較大影響。采用先對單味藥材進行煎煮，然后對單煎液進行配伍的思路，可以消除藥材共煎過程中山茱萸組分和熟地組分之間的相互作用。對比結(jié)果說明，熟地對山茱萸組分的影響不僅僅在煎煮過程中進行，常溫下也可以進行。在實驗過程中，未發(fā)現(xiàn)合煎液或者單煎合并液出現(xiàn)沉淀。從化學成分角度考慮，組分含量的變化可能是因為熟地中的主要成分為寡糖和環(huán)烯醚萜苷類，熟地中某種成分促進了沒食子酸的溶出，而熟地中的環(huán)烯醚萜苷類成分與山茱萸中環(huán)烯醚萜類——莫諾苷和馬錢苷存在溶出競爭，引起莫諾苷和馬錢苷溶解度下降，或者部分形成新的化合物而減少了莫諾苷和馬錢苷的含量檢出。

表2 各樣品中莫諾苷、馬錢苷和沒食子酸的質(zhì)量百分含量Table 2 Percentage of Morroniside, Loganin and Gallic acid in samples

圖2 3種組分的配伍比例與百分含量之間的變化趨勢Fig.2 Variations of fractional contents of Morroniside、Loganin and Gallic acid at different proportions

2.3電噴霧質(zhì)譜分析

電噴霧質(zhì)譜儀采用電噴霧電離(ESI)，屬于軟電離質(zhì)譜技術(shù)，通常不形成碎片離子，只形成分子離子峰，因此可以認為，采用電噴霧質(zhì)譜一級全掃描得到的譜圖中的各峰反映了樣品中的不同組分。山茱萸單煎液樣品(a)、熟地單煎液樣品(b)、經(jīng)典配伍比例4∶8的合煎液樣品(c)和4∶8單煎合并溶液樣品(d)負離子模式下的電噴霧一級全掃描圖示于圖3。 比較各質(zhì)譜圖中分子離子峰的質(zhì)荷比和相對峰強度，并對山茱萸中已知的化合物進行歸屬，結(jié)果列于表3?？梢钥闯?1)除了m/z837的峰，其它在山茱萸單煎液中可以檢測到的質(zhì)譜峰，在合煎液和單煎合并液中都可以檢測到；而部分在熟地單煎液中可以檢測到的質(zhì)譜峰，未在合煎液或者單煎合并液中出現(xiàn)。2)在合煎液中出現(xiàn)了在單煎液中找不到的m/z623、879和1 418峰，在單煎合并液中找到了在單煎液中未曾出現(xiàn)的m/z1 143和1 305峰。這些結(jié)果表明，定性分析山茱萸與熟地配伍時，山茱萸中化學成分受到的影響較小，而熟地化學成分受到了更多的影響，二藥的相互作用使得原本在單煎過程中可以很好地溶出組分在合煎和單煎合并過程中不再溶出，煎出液中產(chǎn)生了新的物質(zhì)，并且在合煎液和單煎合并液中發(fā)生了不同的化學反應。

圖3 典型樣品的電噴霧負離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.3 ESI full mass spectra of typical samples in the negative ion mode

表3 典型樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

3 小結(jié)

采用先對單味藥材進行煎煮，然后對單煎液進行配伍的思路可以消除藥材共煎過程中山茱萸組分和熟地組分之間的相互作用。按經(jīng)典配伍比例配制的山茱萸熟地4∶8單煎合溶液中，莫諾苷、馬錢苷的含量低于4∶8合煎液，沒食子酸的含量高于同比例合煎液，這與該3種組分百分含量在不同配伍比例時的變化趨勢吻合，說明熟地組分對山茱萸組分的影響在常溫下也可以進行。

本研究通過山茱萸與熟地單煎、合煎溶出率的比較，發(fā)現(xiàn)山茱萸與熟地有協(xié)同溶出效應；通過HPLC法檢測不同方式、不同比例的配伍溶液中山茱萸有效成分——莫諾苷、馬錢苷和沒食子酸的含量，發(fā)現(xiàn)這3種有效成分的含量隨著熟地配伍比例的增加均呈現(xiàn)線性變化規(guī)律；通過ESI-MS法觀察各配伍溶液的質(zhì)譜行為，發(fā)現(xiàn)山茱萸與熟地之間的作用不僅可以產(chǎn)生單煎液中不存在的新物質(zhì)，還可以抑制熟地中部分組分的溶出。在二藥的共煎與單煎合并過程中，發(fā)生了不同的反應，產(chǎn)生了不同的新物質(zhì)。熟地對山茱萸的作用不受煎煮過程和溫度的影響。中藥配伍過程中變化的方法為深入研究中藥作用機理、加速中藥現(xiàn)代化提供了一條新的思路。

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StudiesonContentsVariationofMainComponentsinFructusCorniafterCombinationwithRadixRehmanniaePreparata

ZHOU Li-li1,2, YANG Shi-bin3, LIU Zhi-qiang1，ZHANG Hui2，HU Mei2，ZHU Jian-hua2

(1．ChangchunCenterofMassSpectrometry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China；2.ShandongProvincialInstituteofProductQualitySupervision&Inspection,Ji’nan250100,China; 3.Aerospace731Hospital,Beijing100074,China)

To study the contents variation of main components inFructusCorni(FC) after combination withRadixRehmanniaePrepatrata(RRP). The reciprocity of FC with RRP were investigated by means of high performance liquid chromatography (HPLC) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) technique in the negative ion mode. FC with RRP was decocted separately, and then the separate aqueous extracts were combined partly. Different proportions of FC with RRP were decocted together. The contents of Morroniside, Loganin and Gallic acid in these samples were analyzed, synchronously, mass action of these samples were examined. FC with RRP promoted each other in dissolving percents in certain suitable quality proportion (FC∶RRP ≤ 4∶8). Together-decocted and single-decocted merger can produce different new materials. The existence of RRP has great influence on the dissolution of components in FC which would not restricted by temperature. It provides a certain science basis for the reasonable Chinese herbal medicine.

Fructuscorni;RadixRehmanniaePrepatrata; combination; HPLC; ESI-MS

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0074-07