石巖，肖新月*，程顯隆，魏鋒，趙英永，林瑞超

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.西北大學(xué)陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069）

冬蟲夏草中游離麥角甾醇的研究

石巖1，肖新月1*，程顯隆1，魏鋒1，趙英永2，林瑞超1

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.西北大學(xué)陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069）

目的：建立冬蟲夏草藥材中麥角甾醇的RP-HPLC含量測定方法。方法：冬蟲夏草藥材粉末經(jīng)甲醇超聲提取后，用RP-HPLC測定。采用Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動相為甲醇－水（98∶2）；流速為1mL·min－1；檢測波長為282nm。結(jié)果：麥角甾醇進(jìn)樣量在0.0 427 2～0.427 2μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 9）；麥角甾醇的平均回收率為98.7%（n＝6）。結(jié)論：采用建立的RP-HPLC方法測定冬蟲夏草藥材中麥角甾醇的含量，方法靈敏、快速、準(zhǔn)確。

冬蟲夏草；含量測定；反相高效液相色潽法；質(zhì)量控制；麥角甾醇

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，四川、青海、西藏、云南、貴州等地均有分布，是我國名貴中藥材，對于肺結(jié)核、痰血、氣喘、盜汗、腰酸背痛，陽痿和遺精等病癥均有療效。據(jù)報道，冬蟲夏草中含粗蛋白、粗纖維、碳水化合物、脂肪、麥角甾醇及其氧化物、D-甘露醇、硬脂酸、尿嘧啶、腺嘌呤、次黃嘌呤等［1-3］。麥角甾醇（ergosterol），又名麥角固醇，是脂溶性維生素D2的前體，其次生代謝產(chǎn)物可產(chǎn)生麥角甾醇氧化物。甾體類成分對真菌有著重要的生理功能，同時還具有多種生物學(xué)活性，因此研究真菌甾體類成分具有十分重要的理論意義和應(yīng)用前景［4-5］。但是，作為真菌類的特征甾體，麥角甾醇在冬蟲夏草研究中并沒有得到足夠重視。本文研究建立了冬蟲夏草中的游離麥角甾醇的RP-HPLC-UV測定方法，取得了良好的效果，以期為評價該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2695-2489高效液相色譜儀（紫外檢測器）；超聲波清洗器；METTLER 105DU電子天平。

麥角甾醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111845-201102）；20批冬蟲夏草樣品為從青海和西藏收集，均由中國食品藥品檢定研究院張繼副主任藥師鑒定為正品。甲醇為色譜純；水為Milipore。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。流動相：甲醇－水（98∶2）。檢測波長：282nm。流速：1mL·min－1。柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取麥角甾醇對照品約5 mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容至50mL，得對照品儲備液。精密量取1mL該儲備液，甲醇稀釋并定容至10mL，得麥角甾醇對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末0.15 g于具塞錐形瓶中，精密加入10mL甲醇，稱重，超聲處理60 min，取出放置至室溫，稱重，用甲醇補(bǔ)重，過0.45μm濾膜，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取麥角甾醇對照品儲備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，甲醇稀釋并定容至25mL，搖勻。按上述色譜條件分別精密吸取稀釋后的對照品溶液20μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，麥角甾醇對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程：Y＝2×106X＋2 427，r＝0.999 9，麥角甾醇的線性范圍為0.042 72～0.427 2μg，該范圍內(nèi)麥角甾醇進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液分別進(jìn)樣6次，每次20μL，測定麥角甾醇峰面積，并計算RSD＝1.18%，表明儀器精密度符合要求。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取1號樣品（青海產(chǎn)）粉末按照供試品溶液制備方式平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL，測定并計算。結(jié)果樣品中麥角甾醇平均含量為0.095%（n＝6），RSD＝1.99%，說明重復(fù)性符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號供試樣品溶液分別于0，2，4，8，12，16，20，24 h進(jìn)樣，測定麥角甾醇峰面積值，計算RSD＝0.68%，表明供試品溶液中麥角甾醇24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的1號樣品粉末0.07 g共6份，分別加入濃度為10.64μg·mL－1的麥角甾醇對照品溶液5mL，依照上述供試品溶液制備方法及色譜條件制樣、測定，并計算回收率見表1。

表1 麥角甾醇對照品回收率試驗(yàn)

2.8 樣品的測定

取各批供試品溶液20μL，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，外標(biāo)定量測得各批樣品中麥角甾醇的含量，色譜圖見圖1。麥角甾醇的具體測定結(jié)果見表2。

圖1 冬蟲夏草中麥角甾醇含量測定HPLC圖

表2 20批冬蟲夏草中麥角甾醇的含量測定／%

3 討論

分別考察了樣品粉末在甲醇中超聲20，40，60，80 min，發(fā)現(xiàn)超聲60 min時麥角甾醇已提取完全，結(jié)合文獻(xiàn)報道［4］，最終確定供試品溶液超聲提取時間為60 min。

通過對麥角甾醇的對照品溶液200～400nm波長范圍的掃描，發(fā)現(xiàn)282nm下的紫外吸收為最大，故選擇該波長為檢測波長。

由于麥角甾醇在C18色譜柱上保留行為較強(qiáng)，所以需要流動相中有機(jī)相的比例較大，筆者考察了甲醇－水和乙腈－水兩種流動相系統(tǒng)，在色譜峰的峰形及保留時間上差別不大，考慮到檢測成本，最終選用甲醇－水系統(tǒng)作為流動相。

利用本文建立的麥角甾醇測定方法，對20批冬蟲夏草樣品（青海產(chǎn)13批，西藏產(chǎn)7批）進(jìn)行測定，結(jié)果表明麥角甾醇含量在0.013%～0.091%。其中青海產(chǎn)冬蟲夏草麥角甾醇含量在0.013%～0.046%，西藏產(chǎn)冬蟲夏草麥角甾醇含量在0.021%～0.091%。從本實(shí)驗(yàn)所測樣品來看，西藏產(chǎn)蟲草的麥角甾醇含量要高于青海產(chǎn)蟲草，但是由于實(shí)驗(yàn)樣品非常昂貴，收集有一定困難，所以收集樣品量不大，以上結(jié)果還需擴(kuò)大收集樣品批數(shù)做進(jìn)一步考察。

［1］石巖，王鋼力，秦文杰，等.冬蟲夏草化學(xué)成分綜述［J］.中醫(yī)研究，2006，19（7）：54-56.

［2］石巖，王鋼力，林瑞超.近紅外技術(shù)測定冬蟲夏草中氨基酸含量［J］.藥物分析雜志，2007，27（1）：90-92.

［3］趙余慶，于明，陳立君，等.冬蟲夏草屬真菌化學(xué)研究概況［J］.中草藥，1999，30（12）：950-953.

［4］趙英永，趙曄，林瑞超，等.RP-HPLC法測定豬苓中麥角甾醇的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（6）：898-900.

［5］李靜，周立剛，文成敬.真菌甾體化合物的研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008.20：165-171.

Study of Ergosterol in Cordyceps

SHIYan1，XIAO Xin-yue1，CHENG Xian-long1，WEIFeng1，ZHAO Ying-yong1，LIN Rui-chao1
（1.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China；2.Biomedicine Key Laboratory of Shanxi Province，Northwest University，Xi′an 710069，China）

Objective：To establish a RP-HPLC method for quantitative analysis of ergosterol in Cordyceps.MethodsA Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）column was used with the mobile phase beingmethanol-water（98∶2），flow rate being 1.0mL·min－1，detecting wavelength being 282nm.Results：The method had good linear relationship within the range of 0.042 72～0.427 2μg（r＝0.999 9）.The average recovery was 98.7%（n＝6），RSD＝4.5%.Conclusion：Themethod is sensitive，quick and accuracy.

Cordyceps；Determination；RP-HPLC；Quality control；Ergosterol

* ［通訊作者］肖新月，E-mail：xiaoxy＠nicpbp.org.cn

2012-06-05）