呂學高，樓肖成，朱正梅，趙軍華

(浙江省東陽玉米研究所，浙江 東陽 322105)

SSR (simple sequence repeats)標記因具有快速、準確，信息含量高、呈共顯性分離、易于分析、重復(fù)可靠等優(yōu)點，被廣泛用于玉米指紋圖譜構(gòu)建、品種真實性鑒定以及純度檢驗［1-3］。利用SSR指紋技術(shù)鑒定區(qū)域試驗品種的一致性和真實性在普通玉米中已于2002年開展，并出臺了相應(yīng)標準，2006年在鮮食甜、糯玉米上也開展了此項工作［4］。作者以浙江省4個甜玉米和3個糯玉米品種為材料，選用38 對玉米SSR 核心引物分析檢測純度，以期為浙江特用玉米新品種保護和種子生產(chǎn)提供參考，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、糧食安全和農(nóng)民利益提供幫助。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

7個特用玉米品種，4個甜玉米是超甜3號(三交種)、超甜4號、浙甜6號、浙甜8號;3個糯玉米分別是浙糯玉1號 (三交種)、浙糯玉3號、浙糯玉4號。38 對引物參照北京農(nóng)林科學院玉米研究中心核心引物篩選［2，5］(表1)，由上海生工生物工程(上海)有限公司合成。SSR 標記在浙江省農(nóng)科院作物與核技術(shù)應(yīng)用研究所分子育種中心檢測。

1.2 方法

玉米基因組DNA 提取。隨機選取超甜3號和浙糯玉1號玉米種子15粒，其余品種10粒，將玉米種子置于20 (夜12 h)～26℃ (晝12 h)培養(yǎng)箱培養(yǎng)至2 葉1 心，取第2 葉片放入1.5 mL 離心管研磨，采用CTAB 法提取玉米總DNA。

SSR 檢測。PCR 擴增反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)體系組成:1 μL 10×Buffer、0.6 μL 25 mmol MgCl2、0.8 μL dNTP (各2.5 mmol)、0.05 μL Taq 酶(5 U·μL-1)、2 μL DNA 模板、2 μL SSR 引物、ddH2O 定容。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55～60℃退火40～60 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃延伸5 min［2，5］。

電泳檢測:3%瓊脂糖凝膠 (0.5× TBE+EB)電泳，10 μL PCR 產(chǎn)物點樣，恒壓300 V，電泳30～60 min，AlphaImager EP 凝膠成像系統(tǒng)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

38 對SSR 引物在7個品種中共篩選出具有多態(tài)性差異引物23對，其中 umc1125y3、bnlg1520K1、phi233376y1、phi041y6 在4個以上品種中均表現(xiàn)多態(tài)性差異，差異多態(tài)性頻率較高。umc2007y4、bnlg1702k1、umc1545y2、bnlg1671y17、umc1429y7 可作為超甜 3號品種純度檢測;umc1125y3、umc1506k12、umc2115k3 可作為超甜4號品種純度檢測;umc1125y3、umc2115k3、phi233376y1 可作為浙甜 6號品種純度檢測;umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、umc2115k3、phi299852y2、phi041y6 可作為浙甜8號品種純度檢 測;umc1125y3、umc1999y3、phi233376y1、umc2163w3 可作為浙糯玉1號品種純度檢測;umc1125y3、umc1429y7 可作為浙糯玉3號品種純度 檢 測;bnlg1702k1、umc1999y3、umc1429y7、phi299852y2、umc2160k3、phi233376y1、phi041y6可作為浙糯玉4號品種純度檢測。

表1 雜交種純度分析的引物

2.2 雜交種純度檢測

由表2 可以看出，7個特用玉米品種超甜3號、超甜4號、浙甜6號、浙甜8號、浙糯玉1號、浙糯玉3號、浙糯玉4號的SSR 平均檢測純度分別為87%，96.8%，96.5%，98.9%，89.3%，95.8%和99.0%。其中超甜3號和浙糯玉1號為三交種，單個引物位點檢測純度最低值分別為78.6% 和66.7%。由于SSR 檢測缺乏三親本完全差異位點，對無差異位點是否來自雙親遺傳難以判定，可能降低該位點檢測純度。

表2 雜交種純度的檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

選用的38 對玉米SSR 引物對7個特用玉米品種進行純度檢測結(jié)果，共篩選差異性引物23 對，其 中，umc1125y3、bnlg1520K1、phi233376y1、phi041y6 等引物在多個品種中表現(xiàn)多態(tài)性。經(jīng)SSR檢測7個特用玉米品種超甜3號、超甜4號、浙甜6號、浙甜8號、浙糯玉1號、浙糯玉3號、浙糯玉4號的純度分別為87.0%，96.8%，96.5%，98.9%，89.3%，95.8%和99.0%。

玉米SSR 標記豐富的多態(tài)性和目前已開發(fā)出2 000 多對玉米SSR 引物數(shù)量，為玉米雜交種純度鑒定提供保障。影響雜交玉米種子純度，通常有多種綜合因素，利用一種SSR 引物可能不能區(qū)分開是什么原因引起的混雜，因此選取那些擴增條帶位置各不相同的引物，將它們組合起來擴增得到的特異分子標記，可以大大提高檢測的準確度［6-8］。

SSR 標記檢測方法是在DNA 分子水平上的檢測手段，SSR 多態(tài)性是與性狀連鎖的DNA 標記，與性狀間有一定的遺傳距離，因而在繁殖過程中可能出現(xiàn)交換導致基因重組，從而造成檢測的誤差。表現(xiàn)在檢測結(jié)果上，分子鑒定獲得的雜交種純度一般低于常規(guī)方法。要解決這一問題，可通過大量樣本的檢測分析，求出校正純度值的回歸方程，計算出更準確的純度值［3］。

目前國內(nèi)外玉米生產(chǎn)上普遍利用單交種，這類雜交種遺傳性狀穩(wěn)定，雜交優(yōu)勢強，增產(chǎn)顯著。三交種的整齊度不如單交種，制種技術(shù)及環(huán)節(jié)也比單交種復(fù)雜，但制種產(chǎn)量比單交種成倍提高，且在特用玉米上有改善品質(zhì)、提高抗性等優(yōu)勢，這類雜交種在國內(nèi)外仍有少量利用［9］。三交種是一個雜合程度較大的遺傳平衡群體，具有較復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)，目前SSR 分子標記技術(shù)應(yīng)用于三交種測定的研究報道較少，如三個親本SSR 完全差異引物的大量篩選、基因交換重組比例、測定群體的擴大等研究有待深入。

［1］邱紅波，戴保威，彭中華.利用SSR 標記對貴州主要玉米種質(zhì)進行遺傳多樣性分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2011，23(4):667-670.

［2］趙久然，王鳳格，郭景倫，等.中國玉米新品種DNA 指紋庫建立系列研究Ⅱ.適于玉米自交系和雜交種指紋圖譜繪制的SSR 核心引物的確定［J］.玉米科學，2003，11(2):3-5，8.

［3］蓋樹鵬，蓋偉玲，王日新.6個玉米雜交種種子純度的SSR 鑒定［J］.種子，2010，29 (7):44-47.

［4］俞琦英，包斐.SSR 指紋技術(shù)在甜、糯玉米區(qū)試中的應(yīng)用［J］.種子，2010，29 (7):55-57，69.

［5］趙久然，王鳳格.玉米品種DNA 指紋鑒定技術(shù):SSR 標記的研究與應(yīng)用［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2011.

［6］辛景樹，郭景倫，賈希海.SSR 技術(shù)在玉米種子純度鑒定上的應(yīng)用 (上)［J］.種子科技，2005 (3):155-157.

［7］辛景樹，郭景倫，賈希海.SSR 技術(shù)在玉米種子純度鑒定上的應(yīng)用 (下)［J］.種子科技，2005 (4):219-221.

［8］袁進成，劉穎慧，郭建東.應(yīng)用SSR 標記技術(shù)鑒定玉米雜交種純度［J］.中國種業(yè)，2009 (9):46-47.

［9］劉必善，向發(fā)洪，田發(fā)端，等.玉米三交種主要特點及配組技術(shù)［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2002 (5):46-48.