劉文杰，孫愛東

(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

檳榔 (Areca catechu Linn)為棕櫚科檳榔屬植物，主產(chǎn)于我國海南、廣東、廣西、云南、福建和臺灣等地以及印度和馬來西亞等國，是我國4 大南藥之一［1］。

響應(yīng)面分析法 (response surface methodology，RSM)是利用合理的試驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。它與過去廣為使用的正交試驗設(shè)計法不同，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對檳榔中檳榔堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化［2］。

抑菌圈法又稱瓊脂平板法或藥劑擴(kuò)散法，是指化合物通過介質(zhì)滲透擴(kuò)散，施藥部位周圍的病菌被殺死，或生長受到限制，從而產(chǎn)生了抑菌圈或透明圈。抑菌圈和化合物濃度之間，在一定范圍內(nèi)呈函數(shù)關(guān)系，通過測定抑菌圈的大小，可以比較抗菌化合物活性的大小。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

檳榔果原料來自海南，取檳榔殼70℃烘干至恒重后，粉碎過80 目 (0.177 mm)篩，即為檳榔原料;氫溴酸檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品，九州同業(yè)公司;溴甲酚綠，分析純，天津津科精細(xì)化工研究所;氫氧化鉀、無水硫酸鈉，分析純，西隴化工股份公司;無水乙醇、乙酸、濃氨水、乙酸鈉、氯仿，分析純，北京化工廠;甲醇，色譜純。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［3］(用于細(xì)菌培養(yǎng)):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 值7.4～7.6。

馬鈴薯培養(yǎng)基 (PDA) (用于霉菌和酵母菌培養(yǎng)):馬鈴薯 (去皮)200 g，蔗糖 (或葡萄糖)20 g，水1 000 mL。

半固體素瓊脂 (用于細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)):瓊脂1 g，水100 mL，121℃濕熱滅菌30 min。

1.2 主要儀器

JAC-600 超聲波中藥處理機(jī) (山東濟(jì)寧超聲電器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE252AA (上海亞榮生化儀器廠);SP22100UV 型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);DK29821 型電熱恒溫水浴鍋 (天津市泰斯特儀器有限公司);DF204 電熱鼓風(fēng)干燥箱 (北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠)。

1.3 試驗方法

1.3.1 檳榔堿的提取

參照文獻(xiàn)［4］，稱量粉碎的檳榔原料10.00 g，在200 mL 的三角瓶中注入85%乙醇溶液，攪拌搖勻，在頻率為40 kHz、超聲功率300 W 條件下進(jìn)行超聲波輔助提取30 min，重復(fù)3 次，回收乙醇。將提取物濃縮至浸膏后，用氨水調(diào)整pH 值至9，得到堿性提取液，加入氯仿萃取3 次，合并浸提液，然后減壓將浸提液濃縮至乙醇含量的20%，靜置過夜，濾除沉淀得到濾液，減壓濃縮后得到檳榔生物堿提取物。

1.3.2 檳榔堿含量的測定方法

本實驗采用溴甲酚綠光度法測定檳榔堿的含量，利用在一定pH 值下，生物堿陽離子和酸性染料陰離子定量結(jié)合生成有色絡(luò)合物，此絡(luò)合物的離子對可以定量被某種有機(jī)溶劑萃取，根據(jù)這一原理通過測萃取液吸光度來測總生物堿含量［5］。

1.3.3 檳榔堿抑菌活性的測定方法

本實驗采用平板打孔法［6-7］研究檳榔堿的抑菌活性，并用涂布和混和平板2種方法接入菌種，以抑菌圈大小作為檳榔堿抑菌活性的指標(biāo)。

涂布法。將配制好的固體培養(yǎng)基融化滅菌后，倒成約4 mm 厚的平板，待凝固后取100 μL 菌懸液置于培養(yǎng)基上，用玻璃涂布棒將菌懸液涂布均勻，制成帶菌平板。

混合平板法。取100 μL 菌懸液置于無菌平皿中，于上述盛有菌液的培養(yǎng)皿中倒入融化滅菌后并冷卻至45℃左右的相應(yīng)培養(yǎng)基迅速搖勻，置水平位置凝固，制成帶菌平板。用滅過菌的直徑為6 mm 的打孔器等間距打4個孔，其中3個孔注入0.1 g·mL-1的氫溴酸檳榔堿溶液100 μL，另外一個孔注入無菌水作對照。

將細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，酵母菌和霉菌于28℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況，采用十字交叉法測定抑菌圈2個垂直方向的直徑大小，取其平均值 (mm)，以抑菌圈直徑作為檳榔堿抑菌活性指標(biāo)，直徑越大抑菌活性越強(qiáng)。每項抑菌試驗均平行重復(fù)3 次，取其平均值作為試驗結(jié)果。

1.3.4 最低抑菌濃度 (MIC)的測定

最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)是指用無菌水配制成一系列不同稀釋度的樣品，制成平板后，向每一稀釋度藥物接種等量的供試菌，培養(yǎng)后觀察生長情況，能抑制細(xì)菌生長的最低濃度即為該樣品的最小抑菌濃度。MIC 是判斷抗菌活性的最重要的指標(biāo)［8］。

MIC 的測定采用二倍稀釋平板法。用無菌水將檳榔提取物逐級稀釋成 200.000，100.000，50.000，25.000，12.500，6.250 和3.125 mg ·mL-1等系列濃度，其余步驟均同抑菌活性實驗，每項抑菌試驗均重復(fù)3 次，細(xì)菌置于37℃培養(yǎng)24 h，真菌于28℃培養(yǎng)48 h 后觀察結(jié)果。完全不生長菌平板的最低樣品濃度即為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

在其他提取因素不變的情況下，分別乙醇濃度、料液比、超聲時間、堿化pH 值4個對檳榔堿提取影響較大的因素進(jìn)行單因素實驗，根據(jù)單因素實驗確定最佳乙醇濃度為78%，料液比1 ∶13，超聲時間25 min，堿化pH 值8。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素影響試驗結(jié)果，選取乙醇濃度 (X4)、料液比 (X3，m/V)、超聲時間 (X1)、堿化pH 值(X2)對檳榔堿提取影響顯著的4個因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用4 因素3 水平的響應(yīng)面分析方法，分析因素的-1，0，1 水平，X1分別為20，30，40 min;X2分別為7，8，9;X3分別為1∶12，1∶14，1∶16;X4分別為65%，75%，85%。

2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

選用了中心復(fù)合模型，做4 因素3 水平共29個實驗點(diǎn) (5個中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析實驗［9］。這29個實驗點(diǎn) (表1)可分為2 類:其一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有24個析因點(diǎn);其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實驗重復(fù)5 次，用以估計實驗誤差。檳榔中檳榔堿提取率為響應(yīng)值 (指標(biāo)值)。

采用Design Expert7.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析［10］，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，對超聲波輔助提取檳榔中檳榔堿的影響因素進(jìn)行更深入的研究和條件優(yōu)化，并作出響應(yīng)面圖 (圖1-6)。

應(yīng)用Design Expert 7.0 軟件進(jìn)行分析，得到檳榔中檳榔堿提取率與各因素變量的二次方程模型。檳榔堿提取率與各因素變量的二次方程模型為:

Y=0.34-5.667×10-3X1+0.028X2-8.750×10-3X3-7.500× 10-4X4-0.026X1X2+1.500×10-3X1X3+0.015X1X4+5.000× 10-4X2X3+3.500×10-3X2X4-5.750×10-3X3X4-0.056X21-

表1 響應(yīng)面分析實驗方案及實驗結(jié)果

圖1 Y=f (X1，X2)的響應(yīng)面

圖2 Y=f (X1，X3)的響應(yīng)面

圖3 Y=f (X1，X4)的響應(yīng)面

圖4 Y=f (X2，X3)的響應(yīng)面

圖5 Y=f (X2，X4)的響應(yīng)面

圖6 Y=f (X3，X4)的響應(yīng)面

2.2.3 方差分析和回歸方程

回歸方程各項的方差分析見表2。

從表3 可以得出，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，Quadratic 回歸方差模型是高度顯著的，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05。從回歸方程各項的方差分析結(jié)果還可以看出方程的失擬項較小，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點(diǎn)對實驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測［11］。從表2 還可以看出，對提取率影響的大小依次為堿化pH 值X2、超聲時間X1、料液比X3、乙醇濃度X4。

表2 回歸方程方差分析結(jié)果

2.2.4 試驗驗證

為了檢測試驗結(jié)果是否與真實情況相一致，根據(jù)上述試驗結(jié)果進(jìn)行了近似驗證試驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為:室溫下，超聲功率600 W，乙醇濃度81%，料液比為1∶13，提取時間為25 min，堿化pH 值為8.3，檳榔堿平均含量0.341%。與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.01%。而且重復(fù)性也很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 抑菌圈測定結(jié)果

表3 可見，氫溴酸檳榔堿對常見細(xì)菌均具有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，但對真菌無抑制作用，實驗中均未有明顯的抑制生長作用。另外，涂布法測量出的抑菌圈直徑均大于混合菌液法，可見抑菌圈測量中使用不同方法得到的結(jié)果不相同。對檳榔堿的抑制作用最敏感的3種細(xì)菌涂布法抑菌圈及混合菌液法結(jié)果分別見圖7 和圖8。

表3 抑菌圈實驗結(jié)果

圖7 涂布法抑菌結(jié)果

圖8 混合菌液法抑菌結(jié)果

由圖7，8 還可以看出，檳榔提取物對供試的革蘭氏陽性細(xì)菌 (G+)和革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)都有非常明顯的抑制作用，而對真菌完全無抑制作用。

2.4 最小抑菌濃度的測定 (MIC)

通過抑菌圈觀察檳榔提取物的抑菌效果后，測定檳榔提取物的MIC［12］，定量分析檳榔堿的抑菌能力 (表4)。

由表4 可知，檳榔提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用。增加提取物濃度，其抑菌活性明顯增高。檳榔提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為12.50 和6.25 mg·mL-1;檳榔提取物對蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度均為25.00 mg·mL-1，抑制作用相對較弱。

表4 檳榔提取物對4種細(xì)菌MIC 的測定結(jié)果

3 小結(jié)

利用響應(yīng)面分析法 (RSM)對超聲波輔助提取檳榔堿工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最優(yōu)方案為超聲功率600 W，乙醇濃度81%，料液比為1 ∶13，提取時間為25 min，堿化pH 值為8.3，用此方法提取檳榔堿平均含量為0.341%。

利用平板打孔法研究檳榔堿提取物對食品中常見的4種細(xì)菌和3種真菌的抑制作用。實驗結(jié)果表明，檳榔提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為12.50 和6.25 mg·mL-1，對蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度均為25.00 mg·mL-1，對釀酒酵母、黑曲霉、根霉這3種真菌沒有抑制作用。檳榔提取物對供試的革蘭氏陽性細(xì)菌 (G+)和革蘭氏陰性細(xì)菌 (G-)都有非常明顯的抑制作用，而對真菌完全無抑制作用，說明其在開發(fā)益齒抗菌產(chǎn)品上有巨大潛力。這些研究為檳榔的綜合利用以及防牙護(hù)齒產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

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