包 斐,王桂躍
(浙江省東陽玉米研究所,浙江 東陽 322100)
隨著我國玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,玉米新品種越來越多,有關(guān)品種遺傳背景、遺傳關(guān)系的研究逐漸深入到分子水平。簡單重復(fù)序列 (simple sequence repeat,SSR)是一種普遍存在于生物基因組中的DNA 片段,并且在不同生物或者相同生物的不同亞種中存在多樣性。SSR 在玉米基因組中也廣泛存在,利用SSR 兩端的保守序列來設(shè)計(jì)引物,通過PCR 擴(kuò)增和電泳檢測,可以將這種多樣性用圖譜的形式表現(xiàn)出來[1]。SSR 指紋庫是將玉米品種不同位點(diǎn)的SSR 多樣性數(shù)據(jù)整合、記錄和編碼,使之成為在一定程度上能夠描述該品種遺傳特性的數(shù)據(jù)庫。試驗(yàn)通過構(gòu)建10個甜、糯玉米雜交品種的F1代及其親本的SSR 指紋庫,探討數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的數(shù)據(jù)要素,分析數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展及其在純度分析、遺傳相似性研究中的應(yīng)用,以便為甜、糯玉米種質(zhì)資源的遺傳分析提供幫助。
參試材料為浙江省甜、糯玉米審定品種浙甜6號,浙甜8號,浙甜9號,超甜135,超甜4號,浙糯玉2號,浙糯玉3號,浙糯玉4號,浙糯玉5號,以及2010-2011年省區(qū)試優(yōu)秀參試品系花甜糯072。均由東陽玉米研究所選育并提供。
參考不同引物在玉米指紋庫構(gòu)建、品種聚類分析中的應(yīng)用情況及在使用中的表現(xiàn)情況綜合選擇了40 對引物 (均可在www.MaizeGDB.com 上搜索到)作為SSR 指紋庫的建庫引物 (表1)。
表1 40 對適合信息庫構(gòu)建的SSR 引物
采用CTAB 法提取植株葉片總DNA。運(yùn)用毛細(xì)管熒光電泳技術(shù)檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,獲得SSR圖譜數(shù)據(jù),并整理構(gòu)建各試驗(yàn)材料的SSR 指紋庫。
根據(jù)SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜,在有譜帶(或特征峰,以下均稱譜帶)的地方記為1,無譜帶的地方記為0,獲得各試驗(yàn)材料的SSR 指紋庫。表2 為各試驗(yàn)材料的SSR40個引物中的2 對引物圖譜信息 (由于數(shù)據(jù)庫較大,僅列舉2 對引物圖譜信息)。
表2 各玉米品種及其親本材料在2個引物位點(diǎn)的SSR 指紋
表2 可以看出,本試驗(yàn)在引物umc1705w1 位點(diǎn)共檢測出了6個等位變異,在引物umc1999Y3位點(diǎn)共檢測出了4個等位變異。各引物等位位點(diǎn)以該位點(diǎn)特征譜帶的片段大小來命名,不同試驗(yàn)材料擴(kuò)增圖譜數(shù)據(jù)以0,1 的數(shù)據(jù)形式對號入座。
2.2.1 純合度分析
自交系材料在其選育過程中由于逐代自交,各等位基因趨于純合,純合程度越高該自交系越穩(wěn)定。因?yàn)榛蚪M的龐大和等位基因的復(fù)雜多樣,一般對于自交系純合程度很難用一個明確的指標(biāo)進(jìn)行衡量。試驗(yàn)在SSR 指紋庫的基礎(chǔ)上,計(jì)算SSR 純合引物位點(diǎn)占所有檢測引物位點(diǎn)的比例,嘗試對各試驗(yàn)材料的純合度進(jìn)行分析。
從表3 可以看出,親本自交系比單交種純合度高,純合度最高的是浙糯玉2號的父、母本和浙糯玉3號的母本,達(dá)到97.4%;純合度最低的是浙甜9號的父本為73.0%。單交種的純合度主要受父母本共同擁有的等位基因數(shù)的影響。純合度最低的是浙甜6號,為35.1%,最高為花甜糯072,達(dá)到67.6%。
表3 各玉米品種及其親本的純合度
2.2.2 篩選出可用于品種純度鑒定的SSR 引物
在單交種生產(chǎn)過程中,由于親本種子的混雜而影響單交種種子純度的情況時有發(fā)生,篩選出具有雙親互補(bǔ)帶型的SSR 引物,并利用其對單交種種子進(jìn)行檢測,可以直接對種子進(jìn)行純度測定,快速高效的檢測出單交種中的親本混雜[2]。試驗(yàn)在SSR指紋庫的基礎(chǔ)上,篩選出對各品種具有雙親互補(bǔ)帶型的SSR 引物2 組 (表4),用于檢測該品種種子的純度,其中第2 組引物作為補(bǔ)充引物。
表4 適用于玉米單交種純度檢測的特異引物
目前SSR 指紋庫數(shù)據(jù)的記錄方法主要有2種,一種基于PAGE 凝膠電泳,其圖譜數(shù)據(jù)是根據(jù)特征譜帶的數(shù)量及其相互位置確定,以0,1 表示;另一種是在引物末端加入熒光標(biāo)記,并利用毛細(xì)管熒光電泳檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小,并直接記錄特征產(chǎn)物的片段大小作為圖譜數(shù)據(jù)。PAGE 凝膠電泳檢測不同樣品DNA 片段大小是通過與Marker 比較得出,但不可能每個泳道都加入Marker,所以片段大小只能用肉眼比較估測,因此數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性受到一定的影響。而熒光電泳通過DNA 分析儀能夠準(zhǔn)確的得出DNA 片段的大小,準(zhǔn)確性更高,同時由于確定了各個引物的BIN,所以不同批次,不同時間的檢測數(shù)據(jù)均能夠很好的整合到數(shù)據(jù)庫中[1-3]。本試驗(yàn)中SSR 指紋以0,1 記錄,但各引物等位位點(diǎn)譜帶的大小已經(jīng)確定,便于不同的圖譜數(shù)據(jù)對號入座,這種記錄方式除較普通的0,1 指紋更容易數(shù)據(jù)整合外,還有利于數(shù)據(jù)進(jìn)一步的開發(fā)利用。
試驗(yàn)結(jié)果顯示,浙甜9號父本和超甜135 母本的純合度相對較低,說明這2個自交系可能存在一定程度的混雜退化,需要引起重視并進(jìn)行必要的提純工作。親本自交系的純合程度直接影響了F1代的雜種優(yōu)勢,利用SSR 指紋庫數(shù)據(jù)計(jì)算純合位點(diǎn)的比例,可直觀反映出一個自交系材料的純合度,用于長期監(jiān)測自交系材料的穩(wěn)定性情況。
運(yùn)用SSR 標(biāo)記對玉米單交種的純度測試已經(jīng)在國內(nèi)多個實(shí)驗(yàn)室獲得成功[4-7],與RFLP 相比效率更高[8]。試驗(yàn)篩選出2 對適合玉米單交種純度檢測的SSR 特異引物,對制種過程中產(chǎn)生的親本混雜的情況能夠很好的進(jìn)行測定,與傳統(tǒng)的田間觀察相比較而言準(zhǔn)確性更高,速度更快,能大大提高檢測效率。
SSR 用于真?zhèn)舞b定已經(jīng)在不同生物種群開展[3,9]。目前玉米品種的真?zhèn)舞b定,需要通過品種DUS 測試來認(rèn)定。利用SSR 多樣性對品種真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定,需要嚴(yán)格篩選建庫引物,明確界定入庫數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn),建立品種SSR 指紋庫,并結(jié)合形態(tài)性狀的鑒定結(jié)果來綜合說明[10-11]。本試驗(yàn)建立的SSR 指紋庫在各個引物位點(diǎn)上檢測到的等位基因數(shù)量有限,需進(jìn)一步增加檢測材料,將可能出現(xiàn)的新等位變異補(bǔ)充到現(xiàn)有的引物位點(diǎn)內(nèi),并逐步使入庫數(shù)據(jù)更加規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化,為品種的真?zhèn)舞b定和遺傳分析,提供幫助。
[1]李秀平,姜麗靜,劉娜.SSR 分子標(biāo)記技術(shù)及其在構(gòu)建玉米DNA 指紋庫上的應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010(16):47-49,52.
[2]王鳳格,趙久然,郭景倫.中國玉米新品種DNA 指紋庫建立系列研究Ⅰ.玉米品種純度及真?zhèn)舞b定中SSR 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)體系的建立[J].玉米科學(xué),2003,11 (1):3-6.
[3]Huahg J A,L J L,Tan Y P,et al.Tea plant microsatellite genotyping by capillary electrophoresis with four-color fluorescent detection technique [J].Life Science Research,2009,13 (3):251-257.
[4]蓋樹鵬.玉米品種純度SSR 鑒定與田間鑒定的相關(guān)性[J].華北農(nóng)學(xué)報,2010,25 (增刊):28-31.
[5]王鳳格,趙久然,王璐,等.適于玉米雜交種純度鑒定的SSR 核心引物的確定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2007,15(6):964-969.
[6]沈童偉,陸徐忠,劉勛輝,等.SSR 標(biāo)記鑒定玉米品種真實(shí)性及純度的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37 (19):8904-8908,8913.
[7]蓋樹鵬,蓋偉玲,王日新.6個玉米雜交種種子純度的SSR 鑒定[J].種子,2010 (7):44-47.
[8]Smith J S C,Chin E C L,Shu H,et al.An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zeamays L.):Comparison with data from RFLPs and Pedigree [J].Theor Apply Genetics,1997,95:43-48.
[9]黃成志,黃文章,嚴(yán)明建,等.利用SSR 分子標(biāo)記鑒定雜交水稻真?zhèn)闻c純度[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37 (8):3437-3438.
[10]沈童偉,陸徐忠,劉勛輝,等.SSR 標(biāo)記鑒定玉米品種親子關(guān)系的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37 (25):12347-12350,12360.
[11]楊留啟,楊文鵬,王明春,等.12 份糯玉米自交系的SSR標(biāo)記多態(tài)性和分子分類研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37 (8):1-3.