孫麗娟 胡 丹 潘 峰 馬吉獻 蘇靜波

青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、視神經(jīng)外傷等人類主要致盲性眼病，均是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)及其纖維的漸進性死亡為主要特點[1-2]。由于其損傷后不可再生，此類疾病目前尚無有效的治療方法。缺血缺氧是視網(wǎng)膜疾病的共同病理特點之一[3]。視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜內(nèi)最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，依靠其細(xì)胞內(nèi)高親和力 L-谷氨酸/L-天門冬氨酸轉(zhuǎn)運體(glutamate-aspartate transporters，GLAST)維持 RGC細(xì)胞外谷氨酸(glutamate，Glu)濃度，保護RGC免受Glu興奮性毒作用[4-5]。未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)是細(xì)胞在感染、炎癥、細(xì)胞因子、外傷等刺激下，初期表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量非折疊蛋白蓄積，進而觸發(fā)的一系列反應(yīng)[6]。在中樞神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥等疾病中均已被證實。近來研究表明，UPR也可能是RGC及其纖維漸進性死亡的首發(fā)病理機制[7]。本實驗組前期研究證實:視神經(jīng)鉗夾傷后，存在UPR的節(jié)細(xì)胞周圍必然存在強表達GLAST的視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞突起包繞[8]。因此，研究GLAST與UPR相關(guān)因子X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)之間的關(guān)系對RGC的保護有重要的意義。

本實驗應(yīng)用化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑氯化鈷(CoCl2)刺激原代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，觀察缺氧后不同時間點視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞是否存在 UPR，以及GLAST與UPR相關(guān)因子XBP1、CHOP的表達情況。探討UPR與GLAST表達和數(shù)量變化的關(guān)系，為研究視神經(jīng)保護提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 超凈操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國，Thermo公司)、熒光倒置顯微鏡(日本，Olympus公司)、流式細(xì)胞儀(美國，Beckman公司)、胎牛血清(FBS;美國，Gibco公司)、CoCl2(美國，Sigma公司)、DTT(美國，Sigma公司)、XBP1、CHOP、GLAST上下游引物(大連寶生物工程有限公司)、兔抗大鼠GLAST、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)抗體(美國，Abcam 公司 )、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG、羅丹明(TRITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、Trizol總RNA提取液(美國，Invitrogen公司)，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本，Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞原代培養(yǎng) 參考國內(nèi)外研究者方法[9-11]，取出生后3～7 d SD大鼠10只，剝離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。將收集的視網(wǎng)膜剪成約1 mm×1 mm的碎片，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶2 mL，37℃消化20 min。加入含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，充分吹打，懸液經(jīng)篩網(wǎng)(200目)過濾，收集濾液，1000 r·min-1離心 5 min，棄上清，加入2 mL含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，補充含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的DMEM培養(yǎng)基至3 mL，放入含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)。靜置3 d后換液，換液時用吸管輕輕吹打瓶壁，將貼壁不緊的細(xì)胞吹打下來;7～10 d后融合，吸棄原瓶培養(yǎng)基，PBS液洗滌3次，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶，相差顯微鏡下見細(xì)胞收縮、部分細(xì)胞懸浮后停止消化。加入含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如此2～3次，細(xì)胞形態(tài)基本一致后按1∶2比例傳代，傳代后的細(xì)胞改用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)進行鑒定和下一步實驗。

1.2.2 細(xì)胞鑒定

1.2.2.1 細(xì)胞免疫熒光染色 GS參與谷氨酸循環(huán)，是視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞中特異的生物酶[12-13]，可作為特異性標(biāo)志物鑒定Müller細(xì)胞。將100×103個細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中行細(xì)胞免疫熒光染色:40 g·L-1多聚甲醛固定細(xì)胞爬片，室溫30 min;3 g·L-1Triton-X100通透化，室溫孵育30 min;體積分?jǐn)?shù)10%正常山羊血清封閉液，37℃孵育30 min;一抗為兔抗大鼠GS抗體(1∶1000)，4℃過夜;二抗為羅丹明(TRITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100)，37 ℃ 孵育 1 h;4’，6-二脒基-2-2 苯基吲哚(DAPI)襯染胞核10 min;體積分?jǐn)?shù)50%甘油封片。熒光倒置顯微鏡下觀察，照相。

視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞上最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運體——GLAST是位于細(xì)胞膜上的糖蛋白[13]。本實驗將其作為特異性標(biāo)志物鑒定Müller細(xì)胞。操作步驟同細(xì)胞免疫熒光GS染色。一抗為兔抗大鼠GLAST抗體(1∶1000)，4℃過夜;二抗為FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100)，37℃孵育1 h。

1.2.2.2 流式細(xì)胞儀檢測 取第3代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2遍，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×109L-1，取細(xì)胞懸液10 μL，一抗為兔抗大鼠 GLAST抗體(1∶100)，37℃孵育30 min，二抗為FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100)，室溫30 min，離心洗滌2遍，使用流式細(xì)胞儀檢測視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞上GLAST表達陽性率。

1.2.3 實驗分組 取來源于同一原代細(xì)胞的第3代細(xì)胞消化接種(約300×106L-1)于6孔培養(yǎng)板中，待各孔細(xì)胞基本鋪滿板底隨機分為3組:第1組為 CoCl2缺氧[13]干預(yù)組(200 μmol·L-1)，干預(yù)時間分別為:0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，每時間點3孔;第2組為陽性對照二硫蘇糖醇[14](DTT)干預(yù)組(2 mmol·L-1)，干預(yù)時間分別為:0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，每時間點 3 孔;空白對照組 3 孔，仍按含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的DMEM進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 實時熒光定量 PCR檢測 XBP1、CHOP和GLAST的mRNA表達 (1)總RNA提取:Trizol法提取視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計檢測其純度和濃度，8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用合格的RNA標(biāo)本，按試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定其濃度，-20℃保存。(2)引物設(shè)計:應(yīng)用GeneBank基因庫中大鼠XBP1、CHOP、GLAST的mRNA基因序列，由大連寶生物有限公司設(shè)計并合成引物。XBP1引物:上游:5’-GATGAATGCCCTGGTTAC-3’，下游:5’-ATGTTCTGGGGAGGTGAC-3’，大小 150 bp;CHOP 引物:上游 5’-CACAAGCACCTCCCAAAG-3’，下游 5’-TCATTCTCCTGCTCCTTCT-3’，大小 165 bp;GLAST引物:上游 5’-ATGCTGAGTGAAGACTGCAAGGA-3’，下游 5’-GGATGGTTGCCCTCAGAGATG-3’，大小98 bp;β-actin:上游 5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下 游 5’-TTCTCCAGGGAGGAAGAGGAT-3’，大小100 bp。(3)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件:所有cDNA工作液按如下PCR反應(yīng)體系分別配制:核酸凝膠染液 12.5 μL，cDNA 1800 ng，上、下游引物各0.75 μL，加入 ddH2O 定容至 25 μL。RT-PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，95℃ 5 s，60℃退火和延伸30 s，進行40個循環(huán)。在每個循環(huán)的延伸末期檢測熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后電腦自動繪制各目標(biāo)基因的擴增曲線和溶解曲線，并顯示閾值循環(huán)數(shù)(threshold cycles，CT)。以β-actin基因的表達量作為內(nèi)參，校正目標(biāo)基因的表達量，計算公式為:目標(biāo)基因相對表達量 =2-△CT，△CT=CT目標(biāo)基因-CTβ-actin。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件行單因素方差分析(AVONA)及LSD檢驗對實時熒光定量PCR結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞原代培養(yǎng)及細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果 原代細(xì)胞培養(yǎng)8～10 d細(xì)胞融合成單層，細(xì)胞多呈星形、梭形、多角形等形態(tài)，胞漿豐富，核膜清晰，胞核呈橢圓形位于細(xì)胞中央，呈鑲嵌樣排列(圖1)。細(xì)胞免疫熒光GLAST染色:細(xì)胞膜及突起發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞核未著色(圖2)。細(xì)胞免疫熒光GS染色:細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色絲狀及顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞核襯染為藍色(圖3)。顯微鏡下隨機連續(xù)觀察5個高倍視野，每處視野計數(shù)100個細(xì)胞，統(tǒng)計陽性細(xì)胞率發(fā)現(xiàn)，90%以上細(xì)胞GLAST/GS抗體染色陽性。

Figure 1 Image of primary retinal Müller cells under light microscope 光鏡下原代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞

Figure 2 Positive staining of GLAST antibody in retinal Müller cells 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GLAST抗體熒光染色陽性

Figure 3 Positive staining of GS antibody in retinal Müller cells視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS抗體染色陽性

2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 目前Müller細(xì)胞的鑒定主要依據(jù)其細(xì)胞形態(tài)特征及免疫組織化學(xué)的指標(biāo)進行，本實驗利用流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測GLAST在Müller細(xì)胞上的表達情況(圖4)。結(jié)果提示:GLAST表達陽性率為(84.66 ±3.51)%。

2.3 實時熒光定量 PCR檢測 XBP1、CHOP和GLAST的mRNA表達 CoCl2干預(yù)在一定時間內(nèi)誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞上的 XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表達上調(diào)。在干預(yù)后3～24 h，隨著干預(yù)時間延長，三者的表達量也逐漸增加。當(dāng)干預(yù)時間達24 h時，三種因子的mRNA表達水平均達到峰值。之后表達呈下降趨勢(P＜0.05，見表1)。

Figure 4 GLAST expressions in retinal Müller cell identified by flow cytometry 流式細(xì)胞儀檢測視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中GLAST表達

DTT干預(yù)組:刺激后3～24 h，隨干預(yù)時間延長，XBP1、CHOP、GLAST的 mRNA表達上調(diào)且逐漸增加。當(dāng)干預(yù)時間達24 h時，三種因子的mRNA表達水平均達到峰值，之后表達呈下降趨勢;72 h檢測表達量，發(fā)現(xiàn)仍呈下降趨勢(P＜0.05，見表2)。

表1 實時熒光定量PCR檢測缺氧條件下XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表達變化Table 1 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR under hypoxia(±s，n=7)

表1 實時熒光定量PCR檢測缺氧條件下XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表達變化Table 1 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR under hypoxia(±s，n=7)

Note:Compared with control，#P ＜0.05，*P ＜0.01

Group Control 3 hours 6 hours 12 hours 24 hours 48 hours 72 hours XBP1 1.00 ±0.12 1.24 ±0.20# 1.46 ±0.19* 2.76 ±0.31* 3.31 ±0.40* 2.49 ±0.30#1.57 ±0.22 CHOP 0.98 ±0.10 1.14 ±0.19 1.34 ±0.22* 2.26 ±0.32* 3.80 ±0.52* 2.55 ±0.35 1.77 ±0.28 GLAST 1.00 ±0.11 1.12 ±0.13 1.29 ±0.16* 1.82 ±0.25* 2.41 ±0.32*2.02 ±0.29 1.36 ±0.14

表2 實時熒光定量PCR檢測DTT刺激后XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表達變化Table 2 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR after DTT stimulation(±s，n=7)

表2 實時熒光定量PCR檢測DTT刺激后XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表達變化Table 2 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR after DTT stimulation(±s，n=7)

Note:Compared with control，#P ＜0.05，*P ＜0.01

Group Control 3 hours 6 hours 12 hours 24 hours 48 hours 72 hours XBP1 0.95 ±0.10 1.14 ±0.13# 1.33 ±0.17* 2.45 ±0.30* 3.14 ±0.32* 2.35 ±0.27#1.68 ±0.23 CHOP 1.01 ±0.10 1.25 ±0.19 1.34 ±0.21* 2.06 ±0.29* 2.52 ±0.36* 2.11 ±0.28# 1.47 ±0.26 GLAST 0.99 ±0.20 1.05 ±0.19# 1.43 ±0.23* 1.77 ±0.26* 2.26 ±0.28* 1.84 ±0.27*1.56 ±0.22

3 討論

Müller細(xì)胞是脊椎動物視網(wǎng)膜中最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，其胞體位于內(nèi)核層，放射狀突起貫穿視網(wǎng)膜全層呈蜂窩狀，包繞RGC胞體。Müller細(xì)胞的主要功能包括:對RGC的營養(yǎng)支撐、儲存合成糖原、參與血-視網(wǎng)膜屏障、表達電壓門控離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體等，其在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用。研究認(rèn)為細(xì)胞外谷氨酸濃度升高對RGC有潛在毒性[15]。Müller細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞外谷氨酸濃度的關(guān)鍵步驟是通過高親和力的GLAST將這種氨基酸逆著細(xì)胞內(nèi)外濃度差從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，以維持RGC細(xì)胞外正常谷氨酸濃度，達到對RGC的保護作用。Müller細(xì)胞能在30 min內(nèi)將谷氨酸的濃度降至無毒水平，此作用主要與其細(xì)胞膜上谷氨酸轉(zhuǎn)運體的功能和數(shù)量有關(guān)[15]。有研究人員利用反義寡核苷酸技術(shù)阻斷GLAST，發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜玻璃體內(nèi)的谷氨酸濃度和死亡的 RGC都明顯增加[16]。這說明GLAST對視網(wǎng)膜損傷后谷氨酸的清除發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠PC12細(xì)胞缺氧24 h后，谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAC1、GLT-1以及GS表達上調(diào)，并且細(xì)胞外谷氨酸的攝取量增加[17]。而長時間缺氧會使大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLAST、EAAT2表達降低，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸的攝取量減少，缺氧誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在短時間內(nèi)GS、GLAST表達升高[19]。但GLAST在受到外界刺激時變化的原因尚未確切。

UPR是細(xì)胞早期對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)產(chǎn)生的自我保護機制。主要是通過三種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白PERK、IRE-1、ATF6有序活化和整合，降解未折疊蛋白。但當(dāng)刺激持續(xù)存在，就會啟動凋亡程序，由促生存轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲鯷20]。XBP1是需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE-1)通路中的重要分子。具有高度轉(zhuǎn)錄活性的XBP1不僅可誘導(dǎo)ER相關(guān)伴侶分子GRP78表達上調(diào)，且可增加ER相關(guān)未折疊蛋白的降解。CHOP是ERS特異性轉(zhuǎn)錄因子，PERK通路激活后，隨著UPR時間延長，通過誘導(dǎo)CHOP表達升高，進而誘導(dǎo)p53表達而啟動凋亡程序。因此它是UPR從抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)變的重要信號分子之一。有文獻報道脊髓損傷后，脊髓內(nèi)三種細(xì)胞中神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生UPR后都會迅速啟動凋亡程序，而星狀膠質(zhì)細(xì)胞不啟動或難啟動凋亡程序[21]。提示星狀膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)UPR的保護機制具有實際應(yīng)用意義。目前對離體缺氧刺激視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞是否發(fā)生UPR鮮有報道。

本研究結(jié)果顯示，給予視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞缺氧刺激，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，GLAST與UPR相關(guān)因子XBP1、CHOP表達均呈先升高后降低趨勢，在缺氧后24 h表達最高，之后下降。DTT干預(yù)組GLAST與UPR相關(guān)因子XBP1、CHOP表達趨勢與缺氧組一致。本實驗還證實:體外缺氧刺激后視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞存在 UPR;GLAST與 UPR相關(guān)因子XBP1、CHOP的表達趨勢一致。由此推測，缺氧刺激后，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的UPR與GLAST變化有相關(guān)性，可能是GLAST表達變化的啟動因素之一。其原因可能是UPR早期的保護功能使GLAST升高，隨著缺氧時間的延長，UPR凋亡程序啟動使視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞功能減退，GLAST也相應(yīng)減少。但兩者間因果關(guān)系及確切機制尚需進一步探索。

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