賈 喆 張曉敏 趙少貞

角膜移植排斥反應(yīng)主要是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[1]。目前，眼免疫調(diào)控和免疫赦免的大多數(shù)機(jī)制仍不清楚，尤其對(duì)于CD4+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞如何發(fā)揮作用知之甚少，對(duì)于眼部免疫赦免機(jī)制的激活和調(diào)控仍需要進(jìn)一步深入的研究。有研究表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)與前房相關(guān)免疫偏離的誘導(dǎo)相關(guān)[2]。Treg是不同于Th1和Th2的具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體，其中CD4+CD25+Foxp3+Treg是Treg的重要亞群之一，在維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。而Foxp3在CD4+CD25+Treg的產(chǎn)生和功能方面發(fā)揮重要的作用[3]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類多能成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，能夠支持造血和促進(jìn)植入，具有免疫調(diào)控和促進(jìn)組織損傷修復(fù)等功能，并具有易于獲得以及性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[4]。其中MSC免疫調(diào)控作用的發(fā)現(xiàn)是近年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要突破。最新研究表明，MSC可以促進(jìn)Treg的分化和增殖。我們前期研究表明在術(shù)后輸注MSC可以通過抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答和改變Th1/Th2應(yīng)答平衡，顯著抑制大鼠角膜移植排斥反應(yīng)。本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，通過建立大鼠角膜移植排斥動(dòng)物模型，觀察MSC對(duì)異體角膜移植排斥大鼠Treg的作用，進(jìn)一步探討MSC抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用12只成年雌性清潔級(jí)Wistar大鼠(體質(zhì)量200～220 g)雙眼角膜作為供體角膜植片，24只Lewis大鼠(體質(zhì)量200～220 g)右眼作為受體植床，經(jīng)裂隙燈和檢眼鏡檢查屈光間質(zhì)清晰，眼底無病變。飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，室溫18～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)，環(huán)境符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求。Lewis大鼠右眼選為術(shù)眼，以保證術(shù)后大鼠正常活動(dòng)以及進(jìn)食。將動(dòng)物按序編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法將Lewis大鼠隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組各12只。大鼠均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，所有涉及到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)程序都按照天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 主要試劑 FITC標(biāo)記的抗大鼠CD4單克隆抗體，PE標(biāo)記的抗大鼠CD25單克隆抗體，熒光標(biāo)記Foxp3抗體，及匹配的同型對(duì)照IgG(eBioscience公司，美國)。

1.2 角膜移植動(dòng)物模型的制備及臨床觀察 參照文獻(xiàn)[5]的方法建立同種異體穿透性角膜移植的大鼠模型:100 g·L－1水合氯醛 3 mL·kg－1腹腔注射麻醉;術(shù)前充分散瞳，眼結(jié)膜囊表面麻醉;顯微鏡下無菌操作，環(huán)鉆鉆取制作角膜植片(直徑3.5 mm)和植床(直徑3.0 mm);將植片植入植床，10-0尼龍縫線間斷縫合8～10針，自然形成前房。術(shù)畢治療組尾靜脈輸注MSC(5×106mL－1)1 mL，對(duì)照組輸注等體積PBS。于術(shù)后第4天起每天行裂隙燈顯微鏡觀察，記錄排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection index，RI)，對(duì)角膜植片的透明度、水腫程度、新生血管3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分[6]，當(dāng)植片的3個(gè)參數(shù)之和 ≥5，或者植片混濁一項(xiàng)達(dá)到3時(shí)為免疫排斥發(fā)生。

1.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg 檢測(cè)

1.3.1 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 穿透性角膜移植術(shù)后10 d時(shí)，2組分別抽取4只符合觀察條件的受體大鼠處死，取脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，加入4 μL CD4 FITC、4 mL CD25 PE，然后再加 IgG1同型對(duì)照4 μL。室溫下孵育20 min，振蕩后加1 mL紅細(xì)胞裂解液，振蕩，避光孵育 10 min，1500 r·min－1離心 6 min，棄上清，加PBS 2 mL，離心去上清，加入稀釋好的熒光標(biāo)記Foxp3抗體(用Permeabilization Buffer工作液進(jìn)行稀釋)20 μL，避光4℃孵育至少30 min，振蕩重懸，1500 r·min－1離心 6 min，加 10 g·L－1的多聚甲醛0.5 mL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2 脾臟 Foxp3 mRNA的表達(dá) 收集大鼠脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，根據(jù)RTPCR試劑盒說明測(cè)定Foxp3 mRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 根據(jù)RI計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后10 d治療組臨床評(píng)分(4.00±0.63)分，顯著低于對(duì)照組的(5.67 ±1.37)分(P ＜0.05)。

2.2 流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定CD4+CD25+Foxp3+Treg水平 流式細(xì)胞學(xué)方法分析大鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg占 CD4+T細(xì)胞的百分比:治療組為(6.25±0.35)%，較對(duì)照組的(5.45 ±0.38)%明顯升高(P ＜0.05，見圖1)。

2.3 RT-PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，治療組大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為5.65±0.45，顯著高于對(duì)照組的2.13 ±0.74(P ＜0.05)。

3 討論

3.1 大鼠角膜移植排斥模型建立的意義 因?yàn)榻悄っ庖呱饷鈾C(jī)制的存在[7-8]，與其他器官移植相比，角膜移植不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。角膜排斥反應(yīng)主要發(fā)生于高危眼[9]。許多研究表明，在高危植床已發(fā)生了赦免機(jī)制的消除[10-11]，主要表現(xiàn)為維持角膜免疫赦免因素的消失和破壞[12]。本研究在供體、受體主要組織相容性抗原不同的近交系大鼠間(Wistar-Lewis)建立穿透性角膜移植模型[13]，模擬高危眼角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生過程。前期研究發(fā)現(xiàn)，角膜移植對(duì)照組于術(shù)后10 d左右發(fā)生移植排斥反應(yīng)，臨床觀察各模型發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)間穩(wěn)定一致。鑒于此，本研究中我們于角膜移植術(shù)后10 d取材，分析研究角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生過程。

Figure 1 Flow cytometry analysis of rate of CD4+CD25+Foxp3+Treg in spleen cell at 10 days after operation.A:P1:Gated on spleen cell;B:P2:Gated on CD4+Treg;C:Q2:Rate of CD4+CD25+Foxp3+Treg 術(shù)后10 d，流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg所占比例。A:P1門表示選取脾臟中單個(gè)核細(xì)胞;B:P2門代表CD4+T細(xì)胞;C:流式細(xì)胞測(cè)定CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，Q2部分為CD4+CD25+Foxp3+Treg

3.2 CD4+CD25+Foxp+Treg與前房相關(guān)免疫偏離Treg是不同于Th1和Th2的具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體，具有免疫抑制功能，在多種免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)Treg與前房相關(guān)免疫偏離密切相關(guān)[14-16]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化發(fā)育的具體機(jī)制尚不清楚，已被證實(shí)具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特性，可以通過直接細(xì)胞接觸機(jī)制或分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(IL-10和TGF-β)主動(dòng)抑制免疫細(xì)胞的活化，在維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。大量實(shí)驗(yàn)證明[17-20]，CD4+CD25+Treg的發(fā)育及免疫功能的維持與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3有關(guān)。Foxp3可能通過以下4條途徑參與Treg的功能維持:(1)Foxp3能直接抑制效應(yīng)基因的表達(dá)(如IL-2基因的表達(dá));(2)Foxp3能競爭結(jié)合與細(xì)胞活化相關(guān)基因，間接抑制效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄;(3)Foxp3作為一個(gè)轉(zhuǎn)接蛋白招募其他具有抑制功能的效應(yīng)分子與目的基因結(jié)合;(4)上調(diào)某些抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)。有多項(xiàng)研究表明，器官移植術(shù)后，高表達(dá)Foxp3或CD4+CD25+Treg可誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受[21]，F(xiàn)oxp3的表達(dá)水平與有功能的Treg水平密切相關(guān)[22]。Muthukumar等[23]研究發(fā)現(xiàn)在腎移植后出現(xiàn)排斥反應(yīng)的患者，尿液中Foxp3相對(duì)于正常者明顯高表達(dá)，F(xiàn)oxp3的表達(dá)被看成是急性排斥反應(yīng)的標(biāo)志，而且他們認(rèn)為Foxp3表達(dá)越低，移植腎越難存活。Dijke等[24]認(rèn)為，發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)，移植物內(nèi)Foxp3+Treg的高表達(dá)是抑制效應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的一種反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)治療組大鼠脾臟中Foxp3表達(dá)增高，植片存活時(shí)間明顯延長。

3.3 MSC對(duì)Treg的免疫調(diào)控作用 多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明MSC能夠抑制多種免疫細(xì)胞的增殖和功能，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞，來發(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制作用[25-28]。最新研究表明，MSC還可能通過多種機(jī)制影響CD4+CD25+Treg的免疫生物活性[29-31]，比如招募 CD4+CD25+Treg，促進(jìn)其分化，以及維持其免疫抑制活性。同種異源MSC直接與CD4+T細(xì)胞接觸，隨后分泌PGE2和TGF-β，可以促進(jìn)CD4+CD25+Treg的分化和增殖。我們前期研究表明MSC可以通過抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答和改變Th1/Th2應(yīng)答平衡，顯著抑制大鼠角膜移植排斥反應(yīng)。在本研究中，我們采用流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR方法，檢測(cè)了MSC處理組與對(duì)照組脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例及單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MSC治療組大鼠體內(nèi)Treg比例以及Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，表明MSC可能可以通過促進(jìn)Treg的分化和增殖抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。MSC上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Treg的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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