許邦麗 王 婧 齊 欣 楊 碩 盧 弘

急性前葡萄膜炎的發(fā)生主要與革蘭陰性細菌感染有關，革蘭陰性細菌細胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是固有免疫反應的主要啟動因子。Toll樣受體-4(Toll-like receptor-4，TLR-4)是革蘭陰性細菌細胞壁LPS的模式識別受體，在機體的固有免疫和適應性免疫中起重要作用。在我們的前期研究中發(fā)現內毒素誘導的葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis，EIU)中虹膜固有層組織巨噬細胞參與炎癥反應，并發(fā)現在炎癥過程中TLR-4的高表達[1]，提示TLR-4可能在急性前葡萄膜炎的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用[2]，由此我們推測TLR-4與LPS配體結合啟動了炎癥過程。本研究利用髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)通過LPS刺激 C3H/HeN(野生型)小鼠和C3H/HeJ(TLR-4基因缺陷型)小鼠，檢測TLR-4及MyD88在EIU巨噬細胞上的表達，探討TLR-4、MyD88依賴信號途徑在急性前葡萄膜炎發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性C3H/HeN小鼠25只，6～8周齡，購于北京維通利華實驗動物有限公司。雄性C3H/HeJ小鼠5只，6～8周齡，購于南京大學模式動物研究所。C3H/HeN組分為LPS注射后 0 h、12 h、24 h、48 h、72 h 不同時間點，每個時間點5只。

1.1.2 主要試劑與儀器 霍亂弧菌內毒素 LPS(18001株，古典生物型，小川血清型，蘭州生物制品研究所)，TLR-4抗體、MyD88抗體、CD163抗體(美國Santa Cruz公司)，FITC標記驢抗大鼠二抗、TRITC標記驢抗山羊二抗、Dylight649標記的驢抗兔二抗(美國Jackson公司)。眼前節(jié)照相系統(tǒng)(Topcon眼前節(jié)照相系統(tǒng))，立體視顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制作與臨床觀察 將霍亂弧菌內毒素LPS溶于無菌生理鹽水中，配成濃度為2 g·L－1的注射液，每只小鼠腹腔注射0.1 mL，注射后每隔2 h用裂隙燈觀察小鼠眼前節(jié)，必要時復方托品酰胺散瞳檢查，詳細記錄臨床體征并拍照。

1.2.2 動物灌注及標本制備 進行小鼠心臟灌注，以消除血液對免疫組織化學結果的影響。小鼠腹腔注射 175 g·L－1水合氯醛(2 mL·kg－1)深麻醉，麻醉完全后仰臥固定于軟木板上，用體積分數70%酒精消毒，腹部正中切口，至劍突后改為2條旁矢狀切口，暴露胸腔，左心室內插管，插管成功后打開PBS閥門，立即在右心房做一1～2 mm切口使血液和灌注液流出，用肝素化的PBS(pH值7.4，每毫升PBS含1 U肝素)100～150 mL灌注，直至流出液體變?yōu)闊o色時，改為40 g·L－1多聚甲醛50 mL進行固定，可見小鼠肢體僵硬，四肢和尾巴肌肉痙攣，腸系膜血管透明、肝臟蒼白。摘除眼球放入40 g·L－1多聚甲醛中繼續(xù)固定1～2 h后，立體視顯微鏡下，在盛有PBS的培養(yǎng)皿中，將小鼠虹膜、睫狀體分離，放入裝有PBS的Eppendorf管中，置于－80℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 虹膜、睫狀體鋪片免疫熒光三標記 為了觀察整個細胞的形態(tài)，增加組織樣本量，采用虹膜、睫狀體鋪片的方法，用免疫熒光三標記檢測CD163、TLR-4、MyD88的共表達。20 mmol·L－1EDTA 四鈉抗原修復，37℃，3 min，將標本放入24孔培養(yǎng)板，PBS洗5 min×3次;3 g·L－1Triton X-100室溫30 min;PBS洗5 min×3次;含體積分數3%BSA和體積分數10%驢血清的PBS孵育抗原封閉，室溫1 h，PBS洗5 min×3次;1∶50山羊抗小鼠CD163、1∶50大鼠抗小鼠TLR-4、1∶50兔抗小鼠MyD88一抗同時孵育(用 0.2 g·L－1Triton X-100 稀釋)，每孔 200 μL，4℃過夜;第 2天室溫平衡 30 min;PBS洗5 min×3次;在避光條件下，1∶50 TRITC標記驢抗山羊二抗孵育，每孔 200 μL，室溫 2 h;PBS洗10 min×3次;1∶50 FITC標記驢抗大鼠二抗孵育，每孔200 μL，室溫2 h，PBS洗 10 min ×3 次;1∶100 Dylight649標記的驢抗兔二抗孵育，每孔200 μL，室溫2 h，PBS洗10 min×3次;抗熒光衰減封片劑封片。分別以PBS或親和純化正常驢IgG代替一抗作為陰性對照，陰性對照抗體濃度與一抗?jié)舛认嗤?，孵育條件相同，熒光顯微鏡觀察并拍照，相同視野的一對影像重疊后用影像處理軟件(Adobe Photoshop CS3)進行共表達分析。部分鋪片用激光共聚焦顯微鏡檢查。虹膜鋪片每象限取位于虹膜中部的一個高倍鏡視野進行計數，同一視野不同焦點平面進行疊加后總的陽性細胞數為該視野的細胞數。4個視野的平均值作為該眼球虹膜的陽性細胞數。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，全部數據以均數±標準差(±s)表示。對多個樣本虹膜內CD163陽性細胞數、TLR-4陽性細胞數以及MyD88陽性細胞數分別采用單因素方差分析進行檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EIU模型臨床表現 C3H/HeN小鼠霍亂弧菌內毒素LPS注射后12 h結膜囊內出現白色分泌物，瞳孔區(qū)偶見白色滲出，晶狀體前表面可見色素性顆粒，24～48 h時前房內炎癥達到高峰，散瞳后可見部分虹膜后粘連，72 h炎癥逐漸消退(圖1A)。C3H/HeJ小鼠霍亂弧菌內毒素LPS注射后在整個觀察過程中沒有發(fā)現炎癥反應(圖1B)。

2.2 虹膜、睫狀體鋪片免疫熒光三標記 CD163、TLR-4和MyD88的表達 在內毒素誘導的C3H/HeJ小鼠虹膜中未檢測到CD163、TLR-4和 MyD88陽性細胞。而C3H/H3N小鼠注射LPS后，在虹膜和睫狀體中可見CD163標記的巨噬細胞表達，陽性細胞呈綠色熒光，定位于細胞膜、細胞漿，大部分細胞為類圓形。TLR-4陽性細胞呈紅色熒光，MyD88陽性細胞呈藍色熒光，IgG陰性對照中未見陽性細胞的表達(圖2)。C3H/HeN小鼠腹腔注射LPS后在虹膜鋪片內0 h未見TLR-4、MyD88與CD163陽性表達，12 h后可見陽性細胞，24 h陽性細胞數較12 h明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05);48 h陽性細胞數與24 h相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P＞0.05);72 h陽性細胞數較48 h減少，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均為P＜0.01，見表1)。

Figure 1 Clinical manifestations of EIU.A:C3H/HeN mice at 24 hours after LPS injection，part of posterior synechia was seen after mydriasis;B:C3H/HeJ mice after LPS injection，no anterior chamber inflammation was seen EIU模型臨床表現。A:C3H/HeN小鼠注射LPS后24 h，散瞳后部分虹膜后粘連;B:C3H/HeJ小鼠注射LPS后，前房無炎癥表現

Figure 2 Images of immunofluorescence and laser confocal microscope scanning at 24 hours.A:Immunofluorescence displayed CD163 labeled macrophages;B:Immunofluorescence displayed TLR-4;C:Immunofluorescence displayed MyD88;D:Laser confocal microscope scanning clearly showed the co-expression of TLR-4 and MyD88 on macrophages marked by CD163 24 h虹膜免疫熒光與激光共聚焦顯微鏡掃描結果。A:免疫熒光顯示CD163標記的巨噬細胞;B:免疫熒光顯示TLR-4;C:免疫熒光顯示MyD88;D:激光共聚焦顯微鏡掃描顯示TLR-4和MyD88在CD163標記的巨噬細胞上共表達

表1 C3H/HeN小鼠注射LPS后不同時間點CD163、TLR-4、MyD88 陽性細胞數Table 1 CD163+，TLR-4+and MyD88+cells in C3H/HeN mice at different time points after LPS injection

3 討論

葡萄膜炎是常見的致盲眼病，前葡萄膜炎是葡萄膜炎中最常見的一種類型[3]，由于其病因、發(fā)病機制還不十分明確，因此尚無理想有效的治療方法。雖然免疫抑制劑和糖皮質激素有一定的療效，但仍不能阻止葡萄膜炎的復發(fā)，最終致使視功能下降或視力喪失。所以，深入研究急性前葡萄膜炎的發(fā)病機制，尋找新的免疫療法是葡萄膜炎研究領域中的重要課題之一。

有文獻報道，急性前葡萄膜炎的發(fā)生主要與革蘭陰性細菌感染有關[4]。盧弘[5]用霍亂弧菌內毒素在Wistar大鼠成功地誘導出臨床可見的葡萄膜炎。Chang等[6]在正常人虹膜、睫狀體內發(fā)現有 TLR-4陽性的樹突狀細胞。Chen等[1]發(fā)現在大鼠EIU中TLR-4表達增高。

組織固有的巨噬細胞是機體內最早吞噬外來抗原并對感染做出反應的細胞之一。CD163是體內血紅蛋白的特異清道夫受體，也是組織固有巨噬細胞的表面標記蛋白。近年來CD163被認為是選擇性活化的巨噬細胞的標記，表達于巨噬細胞表面的一類模式識別受體，且在免疫抑制中起作用[7]，能識別細菌和真菌細胞壁多糖和脂質，介導吞噬作用。它們以化學修飾的蛋白質、多核苷酸、多糖和磷脂等作為配體并可促進其胞吞作用，起著清除體內有毒物質及衰老、凋亡或壞死細胞的作用。CD163作為一種跨膜蛋白存在于活化的巨噬細胞膜表面，當機體出現炎癥反應時，巨噬細胞大量活化，高表達CD163，本研究發(fā)現虹膜、睫狀體均可見類圓形巨噬細胞，血管周圍多見，且在CD163高表達的同時TLR-4表達也增高。TLR-4基因敲除的小鼠不能誘導出葡萄膜炎。同樣本研究在小鼠EIU模型的虹膜鋪片中，用免疫熒光三標記的方法進一步證實了在巨噬細胞上TLR-4和MyD88共表達，MyD88與TLR-4的表達曲線基本一致，TLR-4基因敲除的小鼠 TLR-4和MyD88均無表達，提示在TLR-4的介導下巨噬細胞參與了機體的固有免疫，可能通過MyD88依賴信號途徑導致后續(xù)炎癥的級聯擴大。

目前發(fā)現TLR信號通路有兩條:一條為MyD88依賴信號途徑，一條為 MyD88非依賴信號途徑。MyD88依賴信號途徑是所有TLR(TLR-3除外)共有的，MyD88為TLR信號轉導途徑中的主要接頭蛋白，它的C端含TLR結構域與TLR胞內區(qū)結合，N端通過死亡結構域(death domain，DD)募集下游含有DD結構域的信號分子使信號下傳，可激活核因子-κB和激活蛋白-1，進而促進核因子-κB控制的基因表達，參與炎癥介質(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α 等)、黏附分子以及NO合酶等的轉錄，促進表達共刺激因子CD40、CD80、CD86，并且通過反饋環(huán)路導致炎癥過程的放大和持續(xù)[8-11]。Li等[12]在大鼠的 EIU模型中發(fā)現TLR4、MyD88、核因子-κB表達上調。這說明急性前葡萄膜炎的發(fā)病過程中，MyD88在LPS活化通路中發(fā)揮著至關重要的作用，TLR-4對其下游信號分子的激活是通過MyD88依賴信號途徑轉導的。Xu等[13]在小鼠EIU模型中，發(fā)現房水中炎癥介質(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α 等)升高。由此，TLR-4可能在急性前葡萄膜炎的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用[14]。

TLR的發(fā)現是免疫學的一項重大進展，TLR-4是一類重要模式識別受體，能識別外源性和內源性配體，TLR能有效識別“非己”成分而被活化，然后通過上調與吞噬有關的基因表達，增強巨噬細胞、中性粒細胞的吞噬能力及殺傷能力，不僅在天然免疫中發(fā)揮重要作用，還是連接天然免疫與特異性免疫的主要橋梁。本研究發(fā)現在C3H/HeN小鼠的EIU模型中，CD163標記的巨噬細胞中TLR-4、MyD88共表達，進一步揭示虹膜固有層巨噬細胞參與了機體的固有免疫，LPS激活了細胞膜表面的TLR-4，并且通過MyD88依賴信號途徑向下游轉導。目前的研究還只是處于初步階段，我們期望通過對轉導通路上的上游關鍵分子的阻斷為治療急性前葡萄膜炎提供新的思路。

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