畢 超 楊 俠 董曉光

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病微血管病變在眼底的獨特表現(xiàn)，是糖尿病患者低視力和致盲的主要原因[1]。目前研究已證實糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGE)在糖尿病微血管并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用[2-3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，AGE-牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin，AGE-BSA)可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)型，細胞的遷移活性及成管能力增強[4]。已知新生血管形成早期的關(guān)鍵步驟是內(nèi)皮細胞的遷移，而細胞遷移的中心環(huán)節(jié)是細胞骨架的重構(gòu)[5]。目前未見AGE影響血管內(nèi)皮細胞遷移過程中骨架重構(gòu)的相關(guān)報道。膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)作為組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)及纖溶酶原的共受體，其促纖溶作用可促進角膜及視網(wǎng)膜新生血管的形成[6-7]。近期研究表明，作為膜-肌動蛋白細胞骨架間的連接，ANXA2可促使小腸上皮細胞骨架重構(gòu)而發(fā)生遷移并涉及細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型及成管活動[8-9]。由此設(shè)想，AGE在DR病程進展中通過誘導(dǎo)細胞骨架重構(gòu)而促進遷移，而ANXA2則在其中發(fā)揮著中介作用。為證實上述假設(shè)，我們以AGE-BSA培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為模型，檢測ANXA2的表達變化，并通過干擾ANXA2的表達觀察細胞微絲骨架及遷移能力的變化，探討ANXA2在DR發(fā)病進展中的作用，以期為視網(wǎng)膜新生血管性疾病的治療尋找有效的作用靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC來自北卡羅來納大學(xué)Cora-Jean S.Edgell惠贈。糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)、牛血清白蛋白(BSA:美國Bio Vision公司)，人源性膜聯(lián)蛋白A2陽性干擾RNA、陰性干擾RNA(ANXA2 siRNA、control siRNA:德國 Qiagen公司)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)，兔抗人ANXA2多克隆抗體、Protein A/G瓊脂糖珠(美國Santa Cruz公司)，酪氨酸磷酸化抗體(美國Cell Signaling公司)，F(xiàn)ITC-鬼筆環(huán)肽(中國聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，山羊抗兔、抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，GAPDH抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HUVEC常規(guī)高糖型DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為25 mmol·L－1，含體積分數(shù)10%FBS、100 ×103U·L－1青霉素，0.1 g·L－1鏈霉素)于37℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分組培養(yǎng)前需降低FBS濃度至2%。

1.2.2 免疫沉淀及Western blot檢測ANXA2蛋白的表達 將細胞種入6孔板，待細胞生長至80%融合時，隨機分為3組:空白對照組、AGE-BSA(0.2 g·L－1)組和 BSA(0.2 g·L－1)組。處理24 h 后，加入裂解液適量，收集細胞，4℃搖床孵育30 min后，4℃ 12 000 r·min－1離心10 min，取上清(另留取樣品作免疫印跡對照)。加入10 μL ANXA2一抗，4℃搖床孵育2 h，再加入20 μL Protein A/G瓊脂糖珠，4℃搖床孵育過夜后，4℃ 2500 r·min－1離心5 min，棄上清后充分洗滌。加入40 μL 1×電泳上樣緩沖液，95℃加熱5 min，所得樣品可暫于－20℃保存。將細胞種入6孔板，待細胞生長至60%融合時，隨機分為3組:空白對照組、control siRNA組及ANXA2 siRNA組。轉(zhuǎn)染24 h后，加入1.5×電泳上樣緩沖液，10 min后刮取樣品，于－20℃保存，用前需進行超聲處理。

樣品SDS-PAGE電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，以酪氨酸磷酸化抗體 P-Tyr-100(1∶1000)/兔抗人ANXA2多克隆抗體(1∶500)和山羊抗小鼠(1∶1500)/兔(1∶3000)IgG抗體孵育，免疫反應(yīng)結(jié)束后使用Western blot熒光劑發(fā)光、顯影。利用Image J軟件對顯影結(jié)果進行分析。

1.2.3 FITC-鬼筆環(huán)肽染色觀察 ANXA2對 HUVEC骨架重塑的影響 將HUVEC接種入24孔板，轉(zhuǎn)染24 h后，隨機分為5組:空白對照組、AGE-BSA(0.2 g·L－1)組、BSA(0.2 g·L－1)組、control siRNA組及ANXA2 siRNA組。分組處理24 h后，PBS洗滌3次，每次5 min。40 g·L－1多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。50 g·L－1BSA 室溫封閉20 min后FITC-鬼筆環(huán)肽室溫避光染色30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。甘油封片后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 劃痕法觀察ANXA2對HUVEC遷移能力的影響 將HUVEC種入6孔板，轉(zhuǎn)染24 h后，隨機分為5 組:空白對照組、AGE-BSA(0.2 g·L－1)組、BSA(0.2 g·L－1)組、control siRNA組及ANXA2 siRNA組。用100 μL微量移液槍頭對各組細胞進行十字劃痕，PBS沖洗細胞2次后分別加入各組培養(yǎng)液，于37℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在0 h、24 h時對各組細胞劃痕進行拍照，隨機選取3個視野計算遷移到劃痕內(nèi)的細胞數(shù)。用劃痕后24 h細胞長入劃痕內(nèi)修復(fù)劃痕的速度來衡量細胞的遷移活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差統(tǒng)計分析(LSD法)，數(shù)據(jù)資料來自3次獨立重復(fù)實驗，均以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANXA2 siRNA抑制ANXA2蛋白的表達ANXA2 siRNA和control siRNA與內(nèi)皮細胞共孵育48 h后，Western Blot檢測ANXA2蛋白表達水平的變化見圖1，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ANXA2 siRNA可顯著下調(diào)ANXA2的表達，而control siRNA則無此作用(表1)。

2.2 抑制ANXA2的表達對內(nèi)皮細胞骨架及遷移能力的影響

2.2.1 ANXA2 siRNA 抑制 AGE-BSA 誘導(dǎo)的 F-actin形態(tài)的改變 0.2 g·L－1BSA刺激24 h同正常培養(yǎng)的HUVEC相比，細胞微絲骨架未見明顯變化，二者均平行排布，可及細胞周邊應(yīng)力纖維較稀疏;0.2 g·L－1AGE-BSA 刺激24 h后，細胞內(nèi)應(yīng)力纖維排布雜亂，似向中央聚集，應(yīng)力纖維亦變密集;預(yù)轉(zhuǎn)染control siRNA的內(nèi)皮細胞，繼以0.2 g·L－1AGE-BSA刺激24 h后，微絲骨架同僅接受AGE-BSA刺激的細胞相比未見明顯變化;而預(yù)轉(zhuǎn)染ANXA2 siRNA的內(nèi)皮細胞，則可抑制AGE-BSA所誘導(dǎo)的F-actin重構(gòu)，由此證明ANXA2蛋白參與了AGE所誘導(dǎo)的細胞微絲骨架重構(gòu)(圖2)。

2.2.2 ANXA2 siRNA抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移能力的改變 劃痕實驗檢測細胞遷移能力變化的結(jié)果顯示，0.2 g·L－1AGE-BSA 刺激24 h可顯著增強內(nèi)皮細胞的遷移能力，而BSA則無此作用。預(yù)轉(zhuǎn)染ANXA2 siRNA可顯著降低AGE-BSA所誘導(dǎo)的遷移能力，預(yù)轉(zhuǎn)染control siRNA則無此作用(圖3，見表2)。

表1 ANXA2 siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞后ANXA2蛋白表達的變化Table 1 ANXA2 protein expression in HUVEC after ANXA2 siRNA transfection(±s)

表1 ANXA2 siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞后ANXA2蛋白表達的變化Table 1 ANXA2 protein expression in HUVEC after ANXA2 siRNA transfection(±s)

Note:Compared with control group，*P ＜0.05

Group Blot density Control 1.17 ±0.03 Control siRNA 1.18 ±0.04 ANXA2 siRNA 0.68 ±0.05*F 152.76 P 0.000

Figure 1 ANXA2 expression in HUVEC decreased after ANXA2 siRNA transfection.A:Untreated group;B:Control siRNA group;C:ANXA2 siRNA group ANXA2 siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞后ANXA2蛋白表達減少。A:對照組;B:陰性干擾組;C:陽性干擾組

Figure 2 Morphous changes of AGE-BSA induced F-actin inhibited by ANXA2 siRNA(×400).A:Control group;B:BSA group;C:AGE-BSA group;D:Control siRNA group;E:ANXA2 siRNA group ANXA2 siRNA抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的F-actin形態(tài)的改變(×400)。A:空白對照組;B:BSA組;C:AGE-BSA組;D:陰性干擾組;E:陽性干擾組

Figure 3 Enhancement of AGE-BSA induced HUVEC migration inhibited by ANXA2 siRNA(×100).A:Control group;B:BSA group;C:AGE-BSA group;D:Control siRNA group;E:ANXA2 siRNA group ANXA2 siRNA抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移能力增強(×100)。A:空白對照組;B:BSA組;C:AGE-BSA組;D:陰性干擾組;E:陽性干擾組

表2 ANXA2 siRNA抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移能力的變化Table 2 Changes of AGE-BSA induced HUVEC migration inhibited by ANXA2 siRNA(±s)

表2 ANXA2 siRNA抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移能力的變化Table 2 Changes of AGE-BSA induced HUVEC migration inhibited by ANXA2 siRNA(±s)

Note:Compared with control group，*P ＜0.05;Compared with AGE-BSA group，#P ＜0.05

Group Number of cells Control 153±12 BSA 143±16 AGE-BSA 192±8*Control siRNA 176±6 ANXA2 siRNA 142±14#F 10.231 P 0.001

2.3 AGE-BSA引起ANXA2蛋白酪氨酸磷酸化0.2 g·L－1AGE-BSA 刺激 HUVEC 24 h 后，細胞總ANXA2及酪氨酸磷酸化ANXA2表達的結(jié)果顯示，總ANXA2表達水平無明顯改變，而酪氨酸磷酸化ANXA2表達增加。0.2 g·L－1BSA 刺激HUVEC 24 h后，總ANXA2及酪氨酸磷酸化ANXA2表達水平均無明顯改變，提示AGE-BSA可使ANXA2酪氨酸磷酸化，而BSA無此作用(圖4，見表3)。

表3 AGE-BSA引起ANXA2蛋白酪氨酸磷酸化Table 3 Tyrosine phosphorylation of ANXA2 protein induced by AGE-BSA(±s)

表3 AGE-BSA引起ANXA2蛋白酪氨酸磷酸化Table 3 Tyrosine phosphorylation of ANXA2 protein induced by AGE-BSA(±s)

Note:Compared with control group，*P ＜0.05

Group Blot density Control 0.94 ±0.57 BSA 0.94 ±0.32 AGE-BSA 1.12 ±0.95*F 6.899 P 0.028

Figure 4 Tyrosine phosphorylation of ANXA2 protein induced by AGE-BSA.A:Control group;B:BSA group;C:AGE-BSA group

3 討論

AGE是指在非酶促條件下，蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸的游離氨基與葡萄糖或其他還原糖的醛基通過Maillard反應(yīng)生成的穩(wěn)定產(chǎn)物[10]。高糖環(huán)境下，AGE可誘導(dǎo)VEGF過度表達而促進新生血管形成[11-12]，AGE還可下調(diào)VE-鈣黏蛋白的表達破壞血-視網(wǎng)膜屏障[13]。

新生血管的形成涉及內(nèi)皮細胞活化、基底膜降解、細胞外基質(zhì)降解、內(nèi)皮細胞遷移、增殖、緊密連接的形成以及周細胞的聚集等，而內(nèi)皮細胞的遷移則是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。內(nèi)皮細胞遷移過程中，肌動蛋白細胞骨架持續(xù)重塑，絲狀偽足、板狀偽足及應(yīng)力纖維的形成協(xié)同完成細胞前端突出、突出與底質(zhì)的黏著、細胞體前移及牽引尾部往前的重復(fù)循環(huán)。由于研究方法的局限性，研究者無法實時觀察細胞應(yīng)激下肌動蛋白骨架的變化，雖然可以人為將細胞運動分步化，但是細胞運動的瞬時性及連續(xù)性不能忽視。諸多研究表明，當細胞的移動性增強時，應(yīng)力纖維聚集增多;而當細胞的移動性減弱時，應(yīng)力纖維解體減少，而絲狀偽足、板狀偽足的特征并不明顯[14-18]。本實驗中，AGE-BSA組同空白對照組及BSA組相比，細胞微絲骨架應(yīng)力纖維明顯，排布雜亂，數(shù)量增多，同時絲狀偽足也較后兩者明顯;而BSA組骨架排布與空白對照組相比未見明顯變化，胞內(nèi)應(yīng)力纖維同樣分布均勻，且同樣稀疏。應(yīng)激反應(yīng)中應(yīng)力纖維的形成是骨架重構(gòu)的表征，實驗中微絲骨架重排后應(yīng)力纖維似向某一方向聚集，符合細胞遷移運動中應(yīng)力纖維對胞體的牽引作用。同時在遷移實驗中，AGE-BSA組與空白對照組及BSA組相比，相同觀察時間內(nèi)遷移入劃痕的細胞數(shù)明顯多于后兩者，細胞的遷移能力增強，而BSA組同空白對照組相比，相同觀察時間內(nèi)遷移入劃痕的細胞數(shù)無明顯差異。由此可知AGE可影響內(nèi)皮細胞骨架重構(gòu)，進而促進內(nèi)皮細胞的遷移。但是AGE不可能直接作用于細胞骨架。有研究表明[19]，AGE-HSA可通過膜突蛋白磷酸化誘導(dǎo)應(yīng)力纖維生成，細胞收縮而促使細胞通透性增加。由此我們推想，AGE也極可能通過某種中介蛋白重構(gòu)細胞骨架，促使細胞遷移能力增加。

ANXA2是鈣磷脂結(jié)合蛋白Annexin超家族成員之一，與S100A10結(jié)合后形成的異源四聚體(A2/S100A10)2位于內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞膜表面，可以促使tPA與纖溶酶原結(jié)合，水解細胞外基質(zhì)，進而促進新生血管形成及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[6，20-21]。針對ANXA2基因敲除鼠的研究表明，敲除鼠不僅內(nèi)皮細胞的遷移能力降低，而且角膜及視網(wǎng)膜的新生血管明顯減少[7]。除了在細胞膜表面發(fā)揮促纖溶作用，ANXA2還可見于膜-肌動蛋白細胞骨架連接處，提供(調(diào)節(jié))某些膜結(jié)構(gòu)域與肌動蛋白細胞骨架間的連接，進而可影響膜相關(guān)肌動蛋白的狀態(tài)[22-24]。Babbin 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2通過靶向Rho至細胞膜，并協(xié)助激活Rho相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可促使小腸上皮細胞骨架重構(gòu)而發(fā)生遷移。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2酪氨酸磷酸化是幼侖鼠腎細胞在胰島素刺激下啟動Rho/ROCK依賴性肌動蛋白介導(dǎo)的細胞黏附降低而脫離基質(zhì)的關(guān)鍵[25]。de Graauw 等[9]及 Hayes等[26]研究亦證實了 ANXA2酪氨酸磷酸化在誘導(dǎo)骨架重構(gòu)，促使細胞轉(zhuǎn)化及成管中的作用。重要的是，上述研究中在缺乏上游信號刺激時，模擬磷酸化ANXA2的突變體同樣可促使細胞骨架重構(gòu)，細胞表型發(fā)生改變。由此可見，ANXA2作為膜-肌動蛋白細胞骨架間的連接，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細胞轉(zhuǎn)型、黏附、運動等生命活動中發(fā)揮著重要作用，并且ANXA2發(fā)揮生物學(xué)功能的重要環(huán)節(jié)是酪氨酸磷酸化。干擾實驗中，ANXA2陰性干擾組同AGE-BSA組相比，微絲骨架應(yīng)力纖維分布同樣較雜亂，似向胞體中央聚集，而ANXA2陽性干擾組則同空白對照組及BSA組類似，應(yīng)力纖維較稀疏，且排列較均一。同樣在劃痕實驗中，ANXA2陰性干擾組與AGE-BSA組細胞長入修復(fù)劃痕的速度相仿，明顯快于ANXA2陽性干擾組，而ANXA2陽性干擾組與空白對照組及BSA組相比無明顯差異。由此可見，AGE-BSA可促使內(nèi)皮細胞應(yīng)力纖維重排，遷移能力增加，而干擾ANXA2的表達可反轉(zhuǎn)AGE-BSA對內(nèi)皮細胞的上述影響，ANXA2在AGE誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞骨架重構(gòu)，進而促進內(nèi)皮細胞遷移的過程中發(fā)揮著作用。AGE對ANXA2有何影響呢?本實驗表明，AGE-BSA組同空白對照組及 BSA組相比，總ANXA2的表達無明顯差異，而酪氨酸磷酸化ANXA2的表達則明顯增多，但BSA組與空白對照組相比，二者之間酪氨酸磷酸化ANXA2的表達無明顯差異。由此可知，AGE可促使ANXA2發(fā)生酪氨酸磷酸化。由于已證實模擬酪氨酸磷酸化ANXA2的突變體可獨立重構(gòu)細胞骨架，增加細胞的能動性。

我們的研究表明，AGE可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞骨架重構(gòu)而促使內(nèi)皮細胞遷移，而ANXA2則參與其中，并且極可能通過其活化體即酪氨酸磷酸化的ANXA2發(fā)揮中介作用。這既進一步闡明了AGE促進內(nèi)皮細胞遷移的機制，又同時為ANXA2除了通過促纖溶作用促進細胞遷移外，作為膜-骨架連接蛋白也可通過促進細胞骨架重構(gòu)進而影響細胞遷移提供了依據(jù)。雖然已有研究提示ANXA2作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移/新生血管生長的治療靶點的可能[27]，但其明確的作用機制仍需進一步探討。

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