王 存 夏潮涌 傅 婷 李志杰

自1830年Sohlemm在角膜緣發(fā)現(xiàn)角膜神經(jīng)后，人們對角膜神經(jīng)展開了一系列的研究。由于角膜組織沒有血管，因此角膜的營養(yǎng)與代謝基本都由角膜神經(jīng)代勞。角膜上皮含有豐富的神經(jīng)末梢，因此對刺激非常敏感，且具有保護(hù)眼前節(jié)的作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，許多眼表疾病和手術(shù)都與角膜的神經(jīng)支配密切相關(guān)，本文就角膜神經(jīng)目前的研究進(jìn)展作一綜述。

1 概述

1.1 角膜神經(jīng)的起源 角膜神經(jīng)主要包括感覺神經(jīng)、交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)。早期研究證實(shí)，許多哺乳動物如小鼠、猴、貓、大鼠和兔的角膜感覺神經(jīng)大多數(shù)來自三叉神經(jīng)的眼神經(jīng)分支，少數(shù)來自三叉神經(jīng)的上頜支。其實(shí)，Bǎke早在1935年就發(fā)現(xiàn)位于角膜基質(zhì)層的粗神經(jīng)束內(nèi)存在某種纖維，并推測其中較細(xì)的纖維是交感神經(jīng)纖維，但未加以證實(shí)。1993年，Marfurt和Ellis進(jìn)一步證實(shí)所有哺乳動物的角膜都含有來自頸上神經(jīng)節(jié)的交感神經(jīng)纖維，但其密度存在顯著的種系間差異。例如，在兔和貓的角膜中，交感神經(jīng)占角膜神經(jīng)的10%～15%，而在包括人的靈長類動物的角膜中，交感神經(jīng)是極其罕見的[1]。通過選擇性去神經(jīng)和退化神經(jīng)描記法研究小鼠和貓的角膜時(shí)發(fā)現(xiàn)，副交感神經(jīng)來自睫狀神經(jīng)節(jié)。但是關(guān)于人類角膜上是否有副交感神經(jīng)纖維至今仍未明確[2]。

1.2 研究角膜神經(jīng)的方法 從最初使用傳統(tǒng)組織免疫方法和光學(xué)顯微鏡研究角膜神經(jīng)，到后來使用熒光組織免疫法和活體共聚焦顯微鏡描繪角膜神經(jīng)的整體構(gòu)造，短短70 a，研究方法有了突破性的進(jìn)展，但這些方法都各有利弊。氯化金染色法、乙酰膽堿酯酶染色法和美藍(lán)活體組織染色法均使用離體樣本，和體內(nèi)環(huán)境存在不可避免的差異。業(yè)已證實(shí)，人體死后角膜神經(jīng)會立即退化，因此結(jié)果會存在一定的誤差。自90年代中期起，共聚焦顯微鏡被普遍用于檢測人體正常和異常角膜神經(jīng)的形態(tài)學(xué)特征[3]。但是，美中不足的是它無法記錄直徑小于0.5 μm的神經(jīng)分支及末梢。針對這一不足，He等[4]采用改進(jìn)的免疫熒光染色成像法展示上皮與間質(zhì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)節(jié)，并提供了整個(gè)角膜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的橫斷視圖。

辣根過氧化物酶(hores radish peroxidase，HRP)軸漿運(yùn)輸法是檢測角膜神經(jīng)功能學(xué)的主要方法之一。利用HRP逆軸漿運(yùn)輸?shù)奶匦裕瑢RP注射于角膜植片中央，HRP會被逆軸漿運(yùn)輸?shù)饺嫔窠?jīng)節(jié)，再通過固定染色等步驟統(tǒng)計(jì)三叉神經(jīng)節(jié)的個(gè)數(shù)，用以評價(jià)再生神經(jīng)的功能。此外，角膜知覺是反映角膜神經(jīng)功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，角膜感覺功能的檢查包括接觸式和非接觸式兩種。Cochet 2-Bonnet角膜知覺儀操作簡便，且能對角膜知覺進(jìn)行精確定量，是目前最常用的方法之一[5]。

2 角膜神經(jīng)的分布與形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)

位于角膜周圍的神經(jīng)束呈放射狀，分布于角膜表面，并于角膜全厚約前1/3處進(jìn)入角膜。神經(jīng)束在距角膜緣約1 mm處脫去神經(jīng)束膜和髓脂鞘，僅存雪旺細(xì)胞，繼續(xù)向角膜中央方向遷移[1]。在此過程中，神經(jīng)纖維會分為雙叉、三叉或丁字形繼續(xù)前行，行至前彈力層時(shí)，神經(jīng)纖維會在前彈力層下互相重疊形成致密的神經(jīng)叢，然后穿過前彈力層，止于上皮細(xì)胞之間。但是，不同物種角膜神經(jīng)發(fā)育的具體過程有所差異，如C57/BL6小鼠在角膜神經(jīng)發(fā)育初期，神經(jīng)纖維直接呈放射狀伸向角膜中央和上皮，并未事先在角膜外周形成一個(gè)神經(jīng)環(huán)[6]。

2.1 基質(zhì)神經(jīng) 基質(zhì)神經(jīng)位于角膜基質(zhì)的前中部，起源于鞏膜或睫狀體[7]。主要的基質(zhì)神經(jīng)束進(jìn)入角膜后，分支成更細(xì)的基質(zhì)神經(jīng)纖維，并遷移至角膜上皮形成上皮神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[4]。人類正常角膜中基質(zhì)神經(jīng)的直徑為5.5～11.4 μm[3]。部分基質(zhì)神經(jīng)纖維在一些分支點(diǎn)相互連結(jié)形成密度適中的基質(zhì)中部神經(jīng)叢，而位于角膜不同部位的基質(zhì)中部神經(jīng)叢的組成與密度有所差異。位于角膜外周的基質(zhì)中部神經(jīng)叢主要由一些小直徑的直的或彎曲的神經(jīng)纖維以及多彎拐的神經(jīng)纖維組成[8];而角膜中央的基質(zhì)中部神經(jīng)叢則主要由細(xì)的和彎曲的神經(jīng)纖維組成，它的神經(jīng)纖維密度小于角膜外周，而且從解剖學(xué)角度而言更簡單[8]。

國內(nèi)外眼科學(xué)者對人角膜基質(zhì)神經(jīng)束定量分析進(jìn)行了大量的研究[4]。Al-Aqaba 等[9]報(bào)道人類角膜基質(zhì)存在44根神經(jīng)束，而Marfurt等[10]則發(fā)現(xiàn)人類角膜基質(zhì)有71根神經(jīng)束。Oliveira-Soto等[7]使用狹縫掃描共聚焦顯微鏡觀察角膜基質(zhì)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中間和前部的神經(jīng)密度分別是 3.7 mm·mm－2和4.2 mm·mm－2。但是另有文獻(xiàn)報(bào)道，基質(zhì)中間和前部的神經(jīng)密度分別是 0.31 mm·mm－2[11]和 0.45 mm·mm－2[12]。由此可見，角膜基質(zhì)神經(jīng)的數(shù)目和密度仍存在爭議。

2.2 上皮下叢 上皮下叢位于角膜前彈力層和基質(zhì)前部的交界處[3]，主要由直的或彎曲的神經(jīng)纖維和多彎拐神經(jīng)纖維構(gòu)成[8]。第一類神經(jīng)纖維的直徑為(4.09 ±2.15)μm[8]，其中大多數(shù)會穿過前彈力層到達(dá)角膜上皮，形成一部分基質(zhì)淺層;另一部分基質(zhì)淺層則起源于多彎拐的上皮下叢神經(jīng)纖維的遠(yuǎn)端末梢。通常位于角膜不同位置的多彎拐神經(jīng)纖維的密度和形態(tài)都具有很大的差異，因此不難理解角膜外周的上皮下叢神經(jīng)纖維的密度高于角膜中央。Stachs等[13]使用共聚焦顯微鏡得到了簡明的三維角膜前部的重構(gòu)圖，能夠清楚看見上皮下的神經(jīng)叢。

2.3 前彈力層 無論是基質(zhì)神經(jīng)纖維還是上皮下叢神經(jīng)纖維，它們進(jìn)入角膜上皮都必須經(jīng)過前彈力層。猴的角膜神經(jīng)纖維只能在角膜周圍區(qū)域穿過前界層進(jìn)入上皮。神經(jīng)纖維進(jìn)入上皮后，大的神經(jīng)束分支成若干更小的神經(jīng)束，而小的神經(jīng)纖維則急劇旋轉(zhuǎn)90°或更大的角度，平行于角膜表面分布[1]。但是，人的角膜神經(jīng)纖維可從角膜外周和中央穿過前界層到達(dá)上皮，不同位置的角膜神經(jīng)滲透位點(diǎn)的密度會有所差異。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，有(204±59)根上皮下叢的神經(jīng)纖維穿過前彈力層到達(dá)角膜中央直徑為10 mm的區(qū)域，即神經(jīng)滲透位點(diǎn)的密度是 2.60 mm－2[10]。角膜外周(距角膜頂部3～5 mm 的區(qū)域)神經(jīng)滲透位點(diǎn)的密度是3.18 mm－2，是角膜中央(距中央的0～3 mm的區(qū)域)的2倍[8]。

2.4 基質(zhì)淺叢 基質(zhì)淺叢位于前界層和基底上皮之間，包括直的和串珠狀的神經(jīng)纖維，而且串珠狀的神經(jīng)纖維通常位于神經(jīng)束的外周[3]。來自同一基質(zhì)神經(jīng)的一類基質(zhì)淺叢被稱為“上皮索(epithelial leash)”。角膜不同部位的上皮索的密度有所差異，角膜外周的上皮索的密度低于角膜中央。使用共聚焦顯微鏡觀察人角膜時(shí)發(fā)現(xiàn)，人類角膜的基底上皮索的去向不同于其他的哺乳動物[1]。

觀察整個(gè)基底淺叢可見，一些長且彎曲的基底神經(jīng)纖維漸漸向角膜中央前行，最終構(gòu)成一個(gè)螺旋狀集合[8]。人角膜的基底神經(jīng)旋渦結(jié)構(gòu)的地理中心距角膜中央的距離為(2.51±0.23)mm，偏向鼻下方[8]。角膜基底神經(jīng)纖維的長度不一，最短的基底神經(jīng)纖維長度不超過1 mm，主要集中在旋渦中心附近;最長的基底神經(jīng)纖維集中于角膜的上部，長度為6.5～8.0 mm 或更長[8]。研究證實(shí)，角膜上皮基底神經(jīng)密度與年齡沒有相關(guān)性[4]。

2.5 上皮的神經(jīng) 角膜上皮的神經(jīng)分別來自角膜緣表面和結(jié)膜下的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。上皮神經(jīng)包括基底下神經(jīng)纖維和神經(jīng)末梢。其中，上皮內(nèi)的神經(jīng)末梢與角膜敏感度具有密切的關(guān)系。上皮內(nèi)的神經(jīng)末梢均來自基底下的神經(jīng)分支，它們分布于上皮的各層，而且它們的長度、主要去向和形態(tài)學(xué)的復(fù)雜性各不相同。研究發(fā)現(xiàn)，上皮神經(jīng)密度與性別無關(guān)，但與年齡有關(guān)。人角膜上皮的神經(jīng)末梢會隨著年齡的增長而減少，但是基底下神經(jīng)纖維密度隨年齡的變化仍存在爭議[4]。

3 角膜神經(jīng)的再生

角膜神經(jīng)屬于外周神經(jīng)，具有再生能力。然而，通常角膜的神經(jīng)再生是不完全的。角膜神經(jīng)的再生方式有兩種:一種是由傷口周圍未受損的神經(jīng)和傷口內(nèi)再生的實(shí)質(zhì)層神經(jīng)出芽再生，另一種是由傷口周圍粗的神經(jīng)干相繼發(fā)出細(xì)的和中等粗的神經(jīng)纖維，這是一種實(shí)質(zhì)層和上皮下神經(jīng)的真正再生[14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)角膜神經(jīng)再生分為兩個(gè)時(shí)期，首先創(chuàng)傷區(qū)內(nèi)的所有神經(jīng)在短期內(nèi)發(fā)生變性，同時(shí)可見來自傷口周圍完整上皮下叢的粗大而且密集的神經(jīng)軸索，垂直于傷口邊緣走行;其次是傷口極向軸索的變性與第二代軸索的出現(xiàn)，這些軸索來自傷口邊緣或近傷口邊緣的再生的上皮下軸索[14]。

近幾年，術(shù)后角膜神經(jīng)的修復(fù)成為了熱點(diǎn)。神經(jīng)生長因子作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子及免疫調(diào)節(jié)因子，在感覺神經(jīng)元的存活、生長、分化以及促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮著十分重要的作用，可促進(jìn)角膜神經(jīng)的再生[5]。研究證明，無論什么物種，穿透性角膜移植術(shù)后的神經(jīng)再生都非常緩慢，且角膜知覺很難完全恢復(fù)。準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)是目前最常用的近視激光矯正手術(shù)之一。業(yè)已證實(shí)，術(shù)后5 a內(nèi)基質(zhì)神經(jīng)的再生是不完全的，而且角膜中央的敏感性與基質(zhì)神經(jīng)的形態(tài)學(xué)[15]和密度[16]存在著密切的關(guān)系。Darwish等[17]發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)和準(zhǔn)分子激光上皮下角膜磨鑲術(shù)后的任何時(shí)段，基質(zhì)神經(jīng)的參數(shù)都沒有顯著差異。但是，Lee等[16]報(bào)道準(zhǔn)分子激光上皮下角膜磨鑲術(shù)術(shù)后的基質(zhì)層神經(jīng)的再生比準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)快。因此，這兩種手術(shù)后基質(zhì)神經(jīng)的再生速度是否一樣還需要進(jìn)一步確認(rèn)?？梢源_定的是，在準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)后5 a，角膜中央基質(zhì)層神經(jīng)纖維的數(shù)目與正常的一樣，并且其分支模式大致與未接受手術(shù)的正常個(gè)體相同[18]。

4 角膜神經(jīng)及其相關(guān)疾病的研究

4.1 角膜炎 角膜炎分為潰瘍性角膜炎和非潰瘍性角膜炎兩類。研究證實(shí)，患有角膜炎的角膜中央基質(zhì)層神經(jīng)的密度明顯低于正常角膜[19]。角膜炎存在明顯的角膜基質(zhì)神經(jīng)構(gòu)造異常。其異常表現(xiàn)為:在角膜頂部可見一個(gè)由神經(jīng)纖維束構(gòu)成的多彎拐的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而且這些神經(jīng)束會形成閉環(huán);在角膜地形學(xué)的基底，神經(jīng)纖維束沿著基底遷移，并且在此區(qū)域的許多神經(jīng)束都偏向同一個(gè)中心[19]。使用共聚焦顯微鏡觀察感染性角膜炎患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，角膜中央上皮樹突狀細(xì)胞的密度與數(shù)目均增加，而且其形態(tài)發(fā)生改變，但是角膜基底下神經(jīng)卻明顯減少了[20]。角膜炎中比較常見的是單純皰疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)。文獻(xiàn)報(bào)道，兔角膜接種HSVⅠ3 d后，角膜上皮下感覺神經(jīng)叢出現(xiàn)散在分布的末梢神經(jīng)潰變，上皮基底索軸突腫脹和斷裂，隨著病程的進(jìn)展，神經(jīng)病變繼續(xù)加重，但在感染后28 d，光鏡下可以見到神經(jīng)纖維以芽生方式再生。Rosenberg等[10]利用共聚焦顯微鏡，對16眼尚未出現(xiàn)樹突狀角膜潰瘍的病程在1～12個(gè)月的HSK患者進(jìn)行角膜神經(jīng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2眼出現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞變大，2眼上皮下神經(jīng)叢缺失，3眼長神經(jīng)叢數(shù)量明顯減少。最近研究顯示，使用活體內(nèi)共聚焦顯微鏡觀察HSK患者角膜時(shí)發(fā)現(xiàn)，上皮和基質(zhì)的HSK間歇性發(fā)作會漸漸破壞角膜上皮下神經(jīng)旋渦結(jié)構(gòu)的形態(tài)。但是，內(nèi)皮的HSK卻不會對角膜上皮下神經(jīng)旋渦結(jié)構(gòu)的形態(tài)產(chǎn)生影響[21]。

4.2 干眼征 任何降低淚膜(質(zhì)或量)的因素都可造成干眼征發(fā)生。干眼征主要包括水液缺乏型干眼和非水液缺乏型干眼兩種類型。與正常人群對比，兩種類型干眼征都可伴隨角膜基質(zhì)神經(jīng)密度下降[11]或者不改變[22]。另外，干眼病患者的角膜神經(jīng)呈現(xiàn)不正常的形態(tài)改變，這在干燥綜合征患者中表現(xiàn)更明顯，最直觀的改變是角膜神經(jīng)數(shù)量、彎曲度、神經(jīng)分支的增加[23]。其原因可能與應(yīng)激狀態(tài)下由炎癥細(xì)胞分泌過多神經(jīng)生長因子的刺激有關(guān)[24]。但是，角膜神經(jīng)形態(tài)的改變可能不會造成角膜敏感度的降低[22]。

4.3 糖尿病 糖尿病是一種系統(tǒng)性代謝性疾病，可累及全身各個(gè)器官，也可引起角膜神經(jīng)的異常。糖尿病性神經(jīng)病變是最普遍的、花費(fèi)最多的糖尿病性并發(fā)癥。高達(dá)50%的糖尿病患者都有并發(fā)癥，其中糖尿病多發(fā)神經(jīng)病變是一種常見的并發(fā)癥。在糖尿病兔模型中，發(fā)現(xiàn)角膜腎上腺素能神經(jīng)在角膜緣形成的神經(jīng)網(wǎng)叢密度稀疏，行向角膜淺基質(zhì)層的神經(jīng)分支變細(xì)。發(fā)病6周時(shí)，電鏡下發(fā)現(xiàn)角膜神經(jīng)軸突水腫，神經(jīng)纖維分布稀疏不均，有些線粒體呈空泡變性，有些則固縮呈顆粒狀。發(fā)病12周，神經(jīng)軸突則呈現(xiàn)高度水腫，甚至崩解，線粒體也因水腫嚴(yán)重而破裂[25]。Rosenberg 等[26]在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的基質(zhì)神經(jīng)纖維束數(shù)量顯著降低，且角膜敏感性也顯著下降。研究證實(shí)，與正常角膜相比較，糖尿病患者的神經(jīng)纖維密度、長度和分支密度都明顯降低[27]。Chang 等[28]使用了一個(gè)新的方法來定量分析糖尿病患者基質(zhì)神經(jīng)纖維的彎曲度，發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)病變越嚴(yán)重，患者角膜基質(zhì)神經(jīng)纖維的彎曲度就越大。就目前而言，共聚焦顯微鏡是監(jiān)控人類糖尿病患者角膜神經(jīng)病變的最佳檢測和評估工具[29]。

5 結(jié)論

雖然對角膜神經(jīng)的深入研究解決了部分角膜神經(jīng)相關(guān)疾病的預(yù)防與治療工作，但是，仍有許多問題尚待解決，如哪些疾病與角膜神經(jīng)形態(tài)和數(shù)量具有相關(guān)性，如何改善術(shù)后角膜神經(jīng)的再生等。

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