殷俊輝，張長青，牛 鑫，郭尚春，胡 斌，何海燕，汪 泱

(1、上海市第六人民醫(yī)院四肢顯微外科研究所，上海 200233；2、上海市第六人民醫(yī)院骨科，上海 200233)

近年來，關(guān)于血管形成的分子機制的相關(guān)研究逐漸成為研究的熱點，目前公認(rèn)的機制主要是Notch/血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)/神經(jīng)誘導(dǎo)因子調(diào)控機制[1]，已證實miRNA可以影響細(xì)胞命運決定(Cell fate Decision)，其表達量受到血流量的調(diào)控[2]，且在基因調(diào)控血管生成的過程中，miRNA發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs通過靶基因E2Fs來調(diào)控低氧/缺血性的疾病中血管生[3]。

當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的人的細(xì)胞中miRNA超過1400[4]，miRNA是一類長度約18～25nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，由一段具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)、長度約70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)剪切后生成。在動物體內(nèi)，它通過與靶基因mRNA分子3’UTR區(qū)結(jié)合，抑制靶基因的翻譯，負(fù)調(diào)控靶基因的蛋白水平[5]。同一個miRNA可以調(diào)控多個mRNA分子，不同的miRNA也可以調(diào)控同一mRNA分子[6]。根據(jù)預(yù)測，人類細(xì)胞中約1/3的蛋白編碼基因受miRNA的調(diào)控。miRNA有進化上的高度保守性、時序性、組織特異性等特點。研究發(fā)現(xiàn)它在胚胎發(fā)育、細(xì)胞進化、血管形成、腫瘤發(fā)生等許多重要病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7-9]。目前尚未有相關(guān)的文獻資料提示缺血性股骨頭壞死疾病中miRNAs是否具有特異性的改變，本研究的目的旨在初步探討股骨頭壞死患者血漿中miRNA的變化，為研究股骨頭壞死的分子調(diào)控機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 為我院經(jīng)X線及MRI確診為股骨頭壞死III期的病人及健康人作為對照。分別為：確診為激素性股骨頭壞死的患者11例及健康正常對照組4例。收集患者及對照組的血漿，所有標(biāo)本-80°C保存。所有參與患者自愿簽署了知情同意書。

1.1.2 主要儀器 實時定量PCR儀7500(美國ABI)

1.1.3 主要試劑 miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miR-cute miRNA熒光定量檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作。

1.2.2 總RNA純度和濃度的檢測 使用超微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，記錄OD260值。RNA純度檢測：RNA溶液的OD260/OD280的比值(比值范圍1.8～2.1為純度合格)。樣品RNA濃度計算公式為：OD260×40×稀釋倍數(shù)(ng/μl)。

1.2.3 cDNA的合成 按miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作。

1.2.4 實時定量PCR按miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作。以U66為內(nèi)參，引物序列及PCR產(chǎn)物片段大小為mi-RNA210 forwardprimer擴增產(chǎn)物為TgCCTCTgTgCgTgTgACAgC；U66上游：GCAAACTCGATCACTAGCTCTGC下游：AGAAAGAACCACCTCAGTAGTGTCTG擴增產(chǎn)物為117bp。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。變化倍數(shù)大于2為高表達，小于0.5為低表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 以上實驗重復(fù)三遍，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與對照組正常人相比：miRNA-210的表達水平在股骨頭壞死III期的患者血清中明顯升高，其上調(diào)變化倍數(shù)為2.385±0.128(P＜0.05)；在無股骨頭壞死的正常人血漿中則低表達，變化倍數(shù)為0.274±0.004(P＜0.05)。 如圖 1 所示。

圖1 股骨頭壞死患者與正常人血漿中miRNA-210的表達比較對照組：正常人血漿中miRNA-210表達變化；病例組：股骨頭壞死患者血漿中miRNA-210表達變化

3 討論

血性股骨頭壞死(AvNFH，Avascular necrosis of femoral head)至今仍是醫(yī)學(xué)界尚未攻克的難題之一，較其他部位的骨壞死為多見，與多種疾病及創(chuàng)傷有關(guān)。在整個世界范圍內(nèi)，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死者的數(shù)量已呈逐年上升的趨勢，激素性股骨頭壞死占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位，且其發(fā)病率仍呈增長趨勢。自20世紀(jì)70年代以來，骨壞死患者的數(shù)量增加了10倍。男女比例大概是1.6:1，特發(fā)性及激素性骨壞死的發(fā)病年齡在30～50歲[10]。創(chuàng)傷性血流中斷、減壓病、庫欣病、酒精中毒、血紅蛋白病、高血壓病和放射性元素及激素治療均可以導(dǎo)致股骨頭壞死[11-15]。其中服用激素治療的患者中10%-30%會發(fā)生股骨頭壞死。然而，到目前為止，骨壞死的發(fā)病機制仍不清楚。導(dǎo)致股骨頭壞死的最主要的病理生理機制是供應(yīng)股骨頭血管的梗阻和缺血。而有關(guān)其發(fā)病機制的研究甚多，目前有脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說、血管內(nèi)凝血學(xué)說、骨質(zhì)疏松學(xué)說、免疫復(fù)合物沉積引起動脈血管炎學(xué)說、靜脈內(nèi)淤滯引起骨內(nèi)高壓學(xué)說、激素對骨細(xì)胞的細(xì)胞毒作用學(xué)說等。這些學(xué)說雖側(cè)重點各不相同，但最后皆歸結(jié)為共同的一點，即均可導(dǎo)致股骨頭微循環(huán)障礙，引起股骨頭血液供應(yīng)減少，最后發(fā)生股骨頭壞死性改變。

已證實miRNA-210在缺氧導(dǎo)致的血管新生及細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生、DNA損傷的修復(fù)、過程中表達量明顯上升。而HIF-α與其表達量的上調(diào)直接相關(guān)[16]。miRNA-210上調(diào)促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生成毛細(xì)血管網(wǎng)[17]。另外miRNA-126、miRNA92a等均已證實與生理或病理性的血管生成具有相關(guān)性[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死患者血漿miRNA-210的表達水平較正常對照組明顯升高，與目前報道較多的心血管系統(tǒng)及腫瘤等疾病中miRNA-210的表達量改變情況基本一致，證明其在股骨頭壞死疾病過程中對股骨頭內(nèi)血管的新生及凋亡可能存在一定的負(fù)調(diào)控作用，提示高表達的miRNA-210可能與股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制有關(guān)，值得進一步研究。

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