陳愛蓉，黃 毅

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

開米拉(Chimeras)是指一個個體中同時存在兩個或以上不同來源的細胞的現(xiàn)象[1]。開米拉可以分為先天性的(如雙生子之間通過血管交叉吻合而產(chǎn)生的)和獲得性的(如異體造血細胞輸注或移植)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的開米拉現(xiàn)象主要有兩種：一種是血型開米拉，也稱做Twin Chimeras，是由于雙生子之間的血管存在交叉吻合，造血細胞通過吻合的血管交換而產(chǎn)生的。另一種開米拉為全身性的開米拉，又稱為 Tetragmetic Chimeras[2，3]，是指同一個體的不同組織中存在著不同來源的細胞的現(xiàn)象。這兩種開米拉現(xiàn)象可以單獨或同時存在。

人類血型開米拉十分罕見，常常是在ABO血型鑒定中檢測到同時存在兩種紅細胞而被發(fā)現(xiàn)的。開米拉現(xiàn)象常常會導(dǎo)致ABO血型遺傳學(xué)的不相符。本文以一例12歲的男孩和他的父母、祖父3代4人的家系為研究對象，對罕見的血型開米拉進行分子遺傳學(xué)的研究。

1 材料與方法

1.1 標本來源 檢測對象是一個12歲的男孩，因發(fā)現(xiàn)右下腹包塊伴腹痛2d入我院，嵌頓疝術(shù)前常規(guī)血型鑒定中發(fā)現(xiàn)血型鑒定困難。我們分別采集了該男孩和他父母、祖父共計4人的血液標本7ml：5ml不抗凝血，用于ABO血型分型；2ml EDTA抗凝血，用于DNA檢測。該家系籍貫為湖南韶山，均沒有輸血史及血液病史，患者為獨生子女。

1.2 實驗方法

1.2.1 ABO血型血清學(xué)鑒定 血型正反定型、吸收放散試驗、唾液型物質(zhì)測定均按常規(guī)標準的試管法，其中2套單克隆抗A、抗B血清(長春博德，長春生物制品有限公司；Dominion Inc，加拿大)，抗AB(Bioscot，英國)、抗 A1 植物凝集素(Immucor公司)、抗H血清(Dominion公司)，反定型紅細胞(上海血液技術(shù)公司)。

1.2.2 ABO基因PCR-SSP(聚合酶鏈式反應(yīng)-序列特異性引物)分型 快速鹽析法從樣本外周血中抽提基因組DNA，DNA樣品于-20°C冷凍保存。使用G&T公司ABO基因分型試劑盒進行等位基因分型[4，5]，該試劑盒含有4對序列特異性引物，通過PCR-SSP分別檢測ABO基因核苷酸序列的A1，A201，O1和B4個等位基因。內(nèi)對照為擴增人類生長激素(HGH)基因的擴增產(chǎn)物為207bp。采用熱啟動技術(shù)即 95℃預(yù)溫 5min，然后 95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s進行30個循環(huán)，72℃延伸 5min進行擴增。PCR產(chǎn)物檢測：4.0%瓊脂糖，10v/cm電泳25min。紫外燈下確定結(jié)果。

1.2.3 家系的ABO基因PCR擴增產(chǎn)物的克隆測序使用自行設(shè)計的引物AF1，AR1，進行包含ABO基因第6外顯子、第6內(nèi)含子、第7外顯子約2200bp片斷的PCR擴增，每種PCR反應(yīng)體系包括dNTP 1mM，MgCl21mM，2×GC buffer Ⅱ2μM，LATaq 酶2U(Takara大連寶生物公司)，模板DNA 200ng/ul，每條引物1μM；終體積50μl。反應(yīng)在PE9600擴增儀上進行，95℃ 10min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃150s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。膠回收，使用TA Cloning Kit試劑盒(Invitrogen公司)進行克隆，使用2.1載體轉(zhuǎn)染進感受態(tài)TOP10細胞，挑取隨機菌株，抽提所需質(zhì)粒DNA(小量質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖?上海華舜公司)，使用表中所列的測序引物 AF2、AF3、AF4、AF5、AF6， 在 ABI 3100 測序儀上檢測，SeqPOP6BDv 1軟件分析結(jié)果。這5個引物都是正向引物，前一引物3’端和后一引物5’端會產(chǎn)生重疊。這樣得到包括完整的Exon6和Exon7的基因序列。

1.2.4 HLA-A、B、DRB1 3個位點的 PCR-SSP分型使用HLA分型試劑盒 (Dynal Biotech LLC，WI53223)，按照廠家提供操作規(guī)程，PCR-SSP法對HLAⅠ類(A，B)，Ⅱ類(DRB1)等位基因分型，瓊脂糖電泳產(chǎn)物，紫外燈下確定結(jié)果。

1.2.5 STR-PCR擴增 用雙盲法復(fù)合短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)位點熒光標記擴增法檢測 15個常染色體位點(D5S818、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11、D18S51、D3S1358、VWA、FGA、TH01、D16D539、D2S1338、D19D433、TPOX、CSF1P0)和1個性染色體Amelogenin位點來鑒定3代親緣關(guān)系。使用ABI AmpFlSTR PCR擴增試劑盒 (Biotest)，對4個家庭成員的DNA擴增，ABI Prism3100 DNA測序儀以及ABI Genotyper 3.7軟件對擴增產(chǎn)物及STR等位基因進行分析。 根據(jù)公式(I=X/Y)，將每個STR結(jié)果與中國南方漢族人群的STR等位基因頻率比對，計算出PI值。

表1 用于克隆擴增及序列測定的引物

2 結(jié)果

2.1 ABO血型鑒定

患者血型鑒定實驗中，正定實驗顯示與抗A、抗B抗體反應(yīng)，肉眼觀察凝集顆粒較小，鏡檢下呈現(xiàn)混合外觀：有凝集的細胞團，有游離的紅細胞；反定實驗顯示該男孩血清中沒有A抗體，B抗體；吸收放散試驗、唾液型物質(zhì)試驗均顯示含A、B抗原，血清學(xué)鑒定該男孩為A3B3型，祖父、父親、母親的血型分別為正常的A型、O型和AB型。血型結(jié)果如圖1。

圖1 罕見開米拉血型家系圖譜

2.2 ABO基因分型及克隆測序結(jié)果

如圖1所示，AB O基因分型祖父為A1O1，父親為O1O1，母親為A1B，而患者的電泳中出現(xiàn)了A1、B1、O13 個等位基因條帶，其中 B1、O1條帶清晰，A1條帶模糊。為排除PCR-SSP法假陽性，進一步運用克隆測序技術(shù)，對患者混合培養(yǎng)的PCR產(chǎn)物隨機挑取得到的21個重組克隆進行分析，與標準序列(A101等位基因，Genbank：AF134412)相比較，這些克隆產(chǎn)物包括1個A102等位基因克隆，6個B101等位基因克隆，以及15個O01等位基因克隆 (如圖2)。 綜上，顯示該男孩為 A102、O01，B101嵌合的三倍體開米拉。

圖2 A102、B101、O01 3個等位基因克隆測序圖譜

2.3 PCR-SSP法HLA分型結(jié)果

HLA-A、B以及HLA-DRB1分型結(jié)果為如下(表2)：表中紅色字為額外的單倍體。本文中電泳條帶不是太清晰故判斷為額外單倍體，可能是此等位基因在體內(nèi)少量存在。

表2 HLA-A、B以及HLA-DRB1分型結(jié)果

2.4 STR-PCR擴增

常染色體STR位點檢測結(jié)果顯示該男孩的D8S1179和vWA位點為三倍體。D8S1179額外的單倍體可能來自于父母雙方，vWA位點額外的單倍體來自父親一方(如圖3)。

圖3 STR位點中D8S1179和vWA位點圖譜

3 討論

在這一家系中，該男孩在外科手術(shù)前常規(guī)血型鑒定出現(xiàn)困難，后經(jīng)詳細的血清學(xué)方法鑒定為A3B3型后，父母分別為O型和AB型，又出現(xiàn)與其父母的血型不符合常規(guī)的遺傳規(guī)律。而STR實驗可確定患者與父母的親權(quán)關(guān)系。深入探討該家系的ABO遺傳基礎(chǔ)顯得非常迫切。

原則上ABO血型遺傳符合孟德爾經(jīng)典的遺傳規(guī)律，到目前為止，只報道過幾例ABO表型和孟德爾遺傳規(guī)律相違背的現(xiàn)象。對這一現(xiàn)象，目前有4種可能的解釋：1、Cis-AB型和B(A)型。Cis-AB型和B(A)型可能與A、B抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶異常有關(guān)。在這兩種情況下，糖基轉(zhuǎn)移酶具有雙重功能活性[6,7]，既可以催化A抗原合成，又能催化B抗原的形成。2、ABO基因亞型的存在。這些亞型的表達程度主要與該等位基因表達增強或者連鎖式遺傳有關(guān)，或者可以說ABO基因在表達過程中會相互影響[8，9]。3、ABO基因的重組和轉(zhuǎn)換，可以引起其表現(xiàn)型的多樣性。在減數(shù)分裂時期，B和O等位基因會融合雜交，這一基因的雜交重組多發(fā)生于第6內(nèi)含子中，重組后的雜交基因表現(xiàn)為A基因活性。這是因為第7外顯子之前的核苷酸為B基因來源，而第7外顯子為O基因來源，且O基因與第6外顯子nt-261位G缺失的A等位基因很相似，故表現(xiàn)為A型。中國和日本已有相關(guān)的家系調(diào)查的報道[10，11]。R102/O雜交型基因個體，由于R102/O雜交基因有nt-261位G的缺失，而表現(xiàn)為O型，但是R102/B雜交基因的個體則表現(xiàn)為B(A)型。4、體內(nèi)同時存在兩種細胞系的開米拉或馬賽克，表達成不同的血型。

本次研究中的這個男孩可確定為一例罕見的血型開米拉：21個混合培養(yǎng)的細胞克隆產(chǎn)物中，除了B101等位基因與O01等位基因，還發(fā)現(xiàn)一個A102單倍體，這可證明該男孩為開米拉血型。HLA-B、DRB1位點也發(fā)現(xiàn)額外單體，STR-PCR的結(jié)果顯示，其15個常染色體位點中有2個位點均發(fā)現(xiàn)有2個以上等位基因，這一結(jié)果也證實了該男孩的開米拉狀態(tài)。

由于患者沒有輸血史和移植病史，家系均為健康人群[12]，可以排除獲得性開米拉。開米拉血型通常是在血液中同時找到兩種來源的紅細胞而被發(fā)現(xiàn)的。這個男孩的血型分型為A3B3型，ABO基因型分型為B101，O01和少量的A102。A，B和O基因的cDNA的結(jié)構(gòu)高度近似[13]。O01基因只比A101基因少了一個核苷酸，即第6外顯子nt261位的G缺失，導(dǎo)致閱讀框架的移位，nt352位之后提前出現(xiàn)終止密碼子，使其在117位氨基酸翻譯后不能形成成熟的氨基酸，即該基因編碼一個截短的蛋白質(zhì)，該蛋白無催化結(jié)構(gòu)域，故O基因為隱性基因。B101基因與A101基因的核苷酸有7個位點不同，即nt297，526，657，703，796，803，930。這些位點的差異，會導(dǎo)致4個氨基酸的改變(Arg176Gly，Gly235Ser，Leu266Met，Gly268Ala)[14]，從而表達4種不同的蛋白質(zhì)。也正是由于這4種氨基酸的改變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶GTA(α-1，3-N乙?；鵇-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TB(α-1，3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)。

在PCR擴增過程中，數(shù)量少的細胞系會與血液中的主體細胞產(chǎn)生競爭性抑制，在常染色體STR中形成一個很小的峰。這一少量的細胞系可以通過PCR-SSP方法檢測到其特異性的等位基因，同時，在HLA-SSP基因分型以及混合培養(yǎng)的細胞克隆產(chǎn)物中，也能發(fā)現(xiàn)。此例中患者低拷貝數(shù)量的A102基因是引起AB表達異常的原因。同時由于競爭性抑制，額外峰常形成比正常峰低的峰，易漏檢；而有些常染色體STR位點沒有出現(xiàn)異常，有一部分原因可能是由于父源或母源中含有相同的重復(fù)數(shù)目而被掩蓋[15，16]。

由于缺少對該男孩的咽拭子、頭發(fā)毛囊、以及指甲等的進一步分析，無法判斷該例患者是否為A102/O01，B101，/O01四倍體全身性的開米拉。四倍體開米拉是在受精過程中，由2個卵細胞和2個精子相互結(jié)合而形成四倍體受精卵，這一受精卵繼續(xù)進行減數(shù)分裂，就可能產(chǎn)生多種不同來源的混合細胞系。我們對該男孩的父母的STR檢測的結(jié)果并不能區(qū)分該男孩是這兩種開米拉中的哪一種，目前暫定為血型開米拉。ABO血型開米拉現(xiàn)象在血型檢測中，僅憑借常規(guī)的檢測技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)。血型開米拉的發(fā)現(xiàn)多數(shù)血型鑒定過程中偶然發(fā)現(xiàn)的。本例血型開米拉的發(fā)現(xiàn)，使我們獲得了一次很難得的研究開米拉遺傳狀態(tài)機會。同時，這一發(fā)現(xiàn)，也為我們再遇到疑難血型以及親子鑒定的疑難結(jié)果提供了一種分析問題的思路與研究方向。

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