吳偉全，李元歌，王思捷，王永存，吳 平

(1、廣東醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 湛江 524001；2、廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，廣東 湛江 524001；3、廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 湛江524001)

隨著生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞內(nèi)離子變化，特別是鈣離子，是目前研究的熱點(diǎn)[1]。而動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞內(nèi)離子變化實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)維持最佳CO2及溫度條件去維持細(xì)胞活性狀態(tài)尤為關(guān)鍵。但是目前活細(xì)胞內(nèi)離子變化動(dòng)態(tài)觀察中，CO2及溫度條件改變對(duì)活細(xì)胞活性狀態(tài)產(chǎn)生影響尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)改變CO2及溫度條件，探討CO2及溫度對(duì)動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞Ca2+變化的影響，為活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)研究中維持最佳CO2及溫度條件提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、主要儀器及試劑 活細(xì)胞A549為本實(shí)驗(yàn)室保存。激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(德國(guó)IncubatorS-2、CTIController 3700 digital、Tempcontrol 37-2 digital)；35 mm NEST激光共聚焦培養(yǎng)皿 (耐思生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；新生小牛血清(民海生物公司)；青霉素-鏈霉素雙抗試劑(杭州吉諾公司)；0.25%胰酶 (Trypsin)-0.02%EDTA溶液 (杭州吉諾公司)；PBS緩沖液(武漢博士德公司)；Fluo-4/AM 熒光染色劑(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 活細(xì)胞A549的激光共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng) 人肺上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞接種于35 mm NEST激光共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)液中,其中含小牛血清10%、青霉素(100 mg/L)和鏈霉素(100 mg/L),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。第二天細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%皿底可用于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察。

1.3 顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立 將顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2安置于激光掃描共聚焦顯微鏡的鏡頭上，IncubatorS-2與溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital及CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital管道聯(lián)通，CTI-Controller 3700 digital再與CO2鋼瓶管道聯(lián)通，建立顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)[2]。

1.4 CO2及溫度的控制和實(shí)驗(yàn)分組 CO2及溫度可以通過(guò)CTI-Controller 3700 digital和Tempcontrol 37-2 digital正常工作進(jìn)行控制。細(xì)胞分為A組：5%CO2維持37℃溫度正常實(shí)驗(yàn)組、B組：無(wú)CO2但維持37℃溫度組和C組：5%CO2室溫溫度組三個(gè)組，每組重復(fù)3次。

1.5 活細(xì)胞Ca2+變化的動(dòng)態(tài)觀察 將各組細(xì)胞培養(yǎng)于35 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中間的圓形凹槽里。染色前吸除培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液，用PBS洗2～3次；向培養(yǎng)皿中輕輕滴入Fluo-4/AM工作液200μl，使其覆蓋凹槽里全部細(xì)胞；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min；吸除染液，用PBS洗2～3次；再用800μl的DMEM高糖培養(yǎng)液覆蓋凹槽里全部細(xì)胞，將激光共聚焦培養(yǎng)皿放在顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2里，加H2O2后，用激光掃描共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察Ca2+的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，采用方差分析(One-Way-ANOVA)，多樣本均數(shù)比較選用LSD法、Dunnett法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能有效控制活細(xì)胞的CO2及溫度 顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2、溫度控制裝置 Tempcontrol 37-2 digital和 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital三者結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡，建立的顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能有效控制CO2及溫度，正常情況下可以維持活細(xì)胞的5%CO2及37℃溫度，以維持活細(xì)胞較好的狀態(tài)(見(jiàn)圖1、圖 2)。

圖1 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital

圖2 溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital

2.2 CO2及溫度對(duì)活細(xì)胞A549內(nèi)Ca2+變化的影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4、圖5和表1。A549細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)鈣離子表達(dá)，表現(xiàn)為綠色熒光，其強(qiáng)弱反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度高低。A組A549細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)較好，加H2O2后熒光強(qiáng)度從2 min到5 min內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增強(qiáng)(P<0.05)；B組A549細(xì)胞大部分呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)一般，加H2O2后熒光強(qiáng)度從1 min到5 min內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步減弱 (P<0.05);C組A549細(xì)胞大部分呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)一般，加H2O2后熒光強(qiáng)度從2 min到5 min內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步減弱 (P<0.05)。與A組的 比較，B 組 1 min、 2 min、3 min、4 min 和 5 min時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度分別減弱(P<0.05)；與A組的比較，C 組 2 min、3 min、4 min 和 5 min 時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度分別減弱(P<0.05)。

3 討論

圖3 A組A549細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化的動(dòng)態(tài)觀察

圖4 B組A549細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化的動(dòng)態(tài)觀察

圖5 C組A549細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化的動(dòng)態(tài)觀察

表1 三組A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度比較

激光掃描共聚焦顯微鏡是80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品，它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞的熒光圖象，在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具[3]。本院臨床醫(yī)學(xué)研究中心配置是德國(guó)Leica TCSII激光掃描共聚焦顯微鏡，具有活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察成像、多重?zé)晒夥蛛x及重組成像和三維重構(gòu)成像等功能。另外通過(guò)顯微培養(yǎng)器IncubatorS-2、溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital和 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital三者結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡，建立的顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其能有效控制CO2及溫度。

細(xì)胞內(nèi)鈣作為第二信使對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化起著重要作用，而目前用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的方法少之又少，激光掃描共聚焦顯微鏡的誕生為人們提供了一種有效工具[4]。研究表明10μM H2O2對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的刺激在短時(shí)間內(nèi)是上升的[5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組A組在5%CO2維持37℃溫度時(shí)，活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果顯示10μM H2O2對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)游離鈣的刺激在短時(shí)間內(nèi)也是上升的，與相關(guān)研究一致。

CO2是細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值[6]。溫度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的有重要意義。維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度(維持37℃)。溫度上升不超過(guò)39℃時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比；41℃1 h，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞線粒體損傷，大部分細(xì)胞調(diào)亡；當(dāng)溫度在43℃以上1h，細(xì)胞全部死亡[7]。而低溫對(duì)細(xì)胞也有一定影響，細(xì)胞處在4℃～36℃之間，細(xì)胞的代謝速度會(huì)減慢[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照組A組是采用CO2及溫度是5%CO2維持37℃，結(jié)果顯示活細(xì)胞A549呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)較好。

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital及CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital改變溫度及CO2，探討CO2及溫度對(duì)動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞Ca2+變化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B組在無(wú)CO2但維持37℃溫度時(shí)，活細(xì)胞A549大部分呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)一般，加藥物后熒光強(qiáng)度從1 min到5 min內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步減弱；與對(duì)照組比較，其 1 min、 2 min、3 min、4 min和 5 min時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度分別減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組在5%CO2室溫溫度時(shí)，活細(xì)胞A549大部分呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)一般，加藥物后熒光強(qiáng)度從2 min到5 min內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步減弱。與對(duì)照組比較，其2 min、3 min、4 min和5 min時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度分別減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CO2及溫度改變對(duì)動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞Ca2+有較大的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果B組及C組的活細(xì)胞由于CO2或溫度的改變，活細(xì)胞狀態(tài)一般，動(dòng)態(tài)觀察中可能發(fā)生熒光淬滅，因此熒光逐步減弱。而A組活細(xì)胞A549呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)較好，因此維持5%CO2及37℃為活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)中CO2及溫度的最佳條件。

[1]Zhou YJ,Song YL,Zhou H,et al.Influx of extracellular calcium participates in rituximab-enhanced ionizing radiation-induced apoptosis in Raji cells[J].Toxicol Lett,2012,209(3):221-6.

[2]Kawaguchi A,Ogawa M,Saito K,et al.Differential expression of Pax6 and Ngn2 between pair-generated cortical neurons [J].J Neurosci Res,2004,78(6):784-95.

[3]Hanrahan O,Harris J,Egan C.Advanced microscopy:laser scanning confocal microscopy[J].Methods Mol Biol.2011,784:169-80.

[4]Ma HL,Xu SS,He RH,et al.Study on Ca2+transmembrane behaviors of magnetic-treated S.aureus with Fura-2/AM fluorescence probe and LCSM[J].Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi,2012,32(2):407-10.

[5]黃文峰,廖貴華.H2O2對(duì)原代培養(yǎng)的豬肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子的影響[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2010,8(19):1-3.

[6]Anderson KM,Jajeh J,Guinan P,et al.In vitro effects of dichloroacetate and CO2on hypoxic HeLa cells.Anticancer Res,2009,29(11):4579-88.

[7]杜 娟,狄和雙,王根林.奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及高溫對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2007,23(3):471-476.

[8]池 貝，劉 娜，董大鵬,等.非凍存低溫下維持貼壁培養(yǎng)細(xì)胞[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,29(1):35-36.