綦天華，丁石博，王再林，李雨庭，宋 慧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

小刺猴頭菌［Hericium caput-medusae(Bull:Fr.)Pers］具有提高機(jī)體耐缺氧能力，提高心血管輸出量，加速血液循環(huán)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，尤其對(duì)胃黏膜有較好的保護(hù)作用。臨床應(yīng)用猴頭菌屬真菌的子實(shí)體及菌絲體提取物治療消化性潰瘍、萎縮性胃炎、肝炎及癌癥輔助治療均有較好效果，并且經(jīng)臨床驗(yàn)證無(wú)毒副作用［1］。猴頭菌具有組織修復(fù)、增強(qiáng)細(xì)胞活力、抗癌、延年益壽和美容等功能?，F(xiàn)在小刺猴頭的應(yīng)用主要體現(xiàn)在多糖方面，但發(fā)酵過(guò)程中除主體多糖外，還有一些小分子物質(zhì)產(chǎn)生。本文旨在通過(guò)現(xiàn)行提取方法以及指紋圖譜技術(shù)對(duì)小刺猴頭菌質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)，也為提高發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物得率提供技術(shù)支持［2-4］。

1 材料

小刺猴頭菌以及猴頭菌(白求恩醫(yī)科大學(xué)藥廠(chǎng));甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

LC-2010HT高效液相色譜儀(日本島津);中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004版)(國(guó)家藥典委員會(huì))。

2 方法

2.1 菌絲體的制備

采用液體搖瓶培養(yǎng)制備。培養(yǎng)基(紅糖4%、蛋白胨 0.3%、CuSO40.002%、ZnSO40.005%、VB10.01%)，分裝于500mL錐形瓶中，每瓶200mL。

將選取的斜面培養(yǎng)基菌絲體用滅菌水2mL進(jìn)行沖洗，將洗菌水接種于新配制的液體培養(yǎng)基中，接菌量0.5mL，轉(zhuǎn)速125 r/min，培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)周期12 d，在3～10 d這8 d(8個(gè)發(fā)酵時(shí)期)內(nèi)，每天取樣1次，過(guò)濾出菌絲體，待用。

2.2 色譜條件

色譜柱 C18色譜柱(Diamonsi 150 mm×4.6 mm)，LcSolution數(shù)據(jù)處理軟件。由預(yù)試驗(yàn)得出結(jié)果，流動(dòng)相:甲醇-水(25∶75)配制溶液，得到最適流動(dòng)相;流速:1.0mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣體積:10μL;記錄時(shí)間:10 min。

2.3 供試品溶液的制備

取菌絲體，用水洗凈，50℃烘干。將菌絲體干粉浸于水中，在80℃水浴浸提3 h，提取液經(jīng)4層紗布熱過(guò)濾后，合并濾液，3 000 r/min離心15 min，上清液濃縮至原來(lái)體積的1/3，用終濃度為95%乙醇沉淀多糖，4℃靜置12 h，3 000 r/min離心15 min，保留上清。冷凍干燥，配制成0.1 g/mL濃度的溶液，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，對(duì)各共有峰保留時(shí)間及峰面積進(jìn)行考察。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品5份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份進(jìn)樣1次，對(duì)各共有峰保留時(shí)間及峰面積進(jìn)行考察。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣，對(duì)各共有峰保留時(shí)間及峰面積進(jìn)行考察。

2.7 菌絲體指紋圖譜的建立［5］

分別吸取供試品溶液各10μL注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版(國(guó)家藥典委員會(huì))軟件對(duì)各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析，以8個(gè)發(fā)酵時(shí)期的樣品菌絲體提取物的對(duì)照?qǐng)D譜(中位數(shù)法)作為對(duì)照模板，計(jì)算各色譜圖的整體相似度，選取7個(gè)共有峰進(jìn)行相似度計(jì)算。譜峰處理:手動(dòng)譜峰匹配。

3 結(jié)果

3.1 HPLC色譜條件的優(yōu)化

色譜條件的選擇主要以流動(dòng)相的濃度、流速、系統(tǒng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，流動(dòng)相方面，將甲醇與水按一定濃度梯度進(jìn)行配制，分別用20%，25%，30%甲醇對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較分離度以及峰型的好壞，得出最適濃度為25%甲醇溶液(圖1)，即甲醇-水(25∶75)。檢測(cè)波長(zhǎng)通過(guò)對(duì)樣品紫外最大吸收波長(zhǎng)230，254，280 nm進(jìn)行比較，最后選擇254 nm時(shí)出峰最多，且峰型較好(圖2)。流速與系統(tǒng)溫度方面，通過(guò)比較，最后得出了最適條件，流速1.0mL/min;系統(tǒng)溫度分別比較30，40℃時(shí)對(duì)于結(jié)果的影響，結(jié)果(圖3)表明，30℃時(shí)能使樣品中各色譜峰的分離度到達(dá)良好且出峰最多。

3.2 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

對(duì)不同濃度提取溶劑、提取方法所得到的指紋圖譜進(jìn)行反復(fù)分析，結(jié)果選擇以水為提取溶劑，采用熱提法進(jìn)行提取，所得到的信息量最多，更適合小分子物質(zhì)反向HPLC指紋圖譜研究［6-7］。

3.3 指紋圖譜方法學(xué)研究結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，說(shuō)明精密度良好;重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)各共有峰保留時(shí)間及峰面積進(jìn)行考察，結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，說(shuō)明重復(fù)性良好;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，說(shuō)明在8 h內(nèi)，樣品溶液穩(wěn)定。

圖1 不同流動(dòng)相對(duì)小刺猴頭檢驗(yàn)的影響Fig.1 Different mobile phase concentration influence on Hericium caput-medusae detection

樣品的測(cè)量結(jié)果表明，其小刺猴頭菌絲體水體小分子全譜相似度分別為0.998，0.999，0.998，1.000，0.999，1.000，0.993，0.996，1.000，即 8 個(gè)時(shí)期的樣品及對(duì)照峰相似度均在0.9以上(見(jiàn)表1)，指紋圖譜保留時(shí)間、峰面積相似度(見(jiàn)表2)均符合質(zhì)量要求。說(shuō)明液體發(fā)酵在這一段時(shí)期內(nèi)主要成分的變化很小，可近似看作不變，說(shuō)明這一段時(shí)期內(nèi)菌絲體的新陳代謝處于平衡狀態(tài)，當(dāng)我們?cè)谌粘z驗(yàn)中得到的譜圖與以上譜圖近似時(shí)，便可確定發(fā)酵的平臺(tái)期，也為發(fā)酵終點(diǎn)的判斷提供依據(jù)。

圖2 不同波長(zhǎng)對(duì)小刺猴頭檢驗(yàn)的影響Fig.2 Different wavelength influences on Hericium caput-medusae detection

圖3 不同溫度對(duì)小刺猴頭檢驗(yàn)的影響Fig.3 Different time influence on Hericium caput-medusae detection

表1 小刺猴頭菌絲體指紋圖譜相似度Tab.1 Similarity of HPLC fingerprint of Hericium caput-medusae's mycelium

表2 小刺猴頭菌絲體指紋圖譜保留時(shí)間，峰面積相似度Tab.2 Similarity of retention time and area on HPLC fingerprint of Hericium caput-medusae's mycelium

3.4 指紋圖譜的建立和辨認(rèn)

對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得不同發(fā)酵時(shí)期小刺猴頭菌絲體提取物的HPLC色譜圖(圖4)、猴頭菌絲體提取物的HPLC色譜圖(圖5)，對(duì)菌絲體提取物的HPLC色譜圖進(jìn)行解析，確定共有7個(gè)共有峰，通過(guò)圖譜對(duì)比構(gòu)建了菌絲體提取物的HPLC色譜圖的指紋特征，作為判斷發(fā)酵平臺(tái)期的依據(jù)。

圖4 小刺猴頭菌8個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期菌絲體提取物的HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint of the Hericium caput-medusae's eight different fermentation mycelia extracts

圖5 猴頭菌8個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期菌絲體提取物的HPLC指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint of the Hericium erinaceum's eight different fermentation mycelia extracts

4 討論

在小刺猴頭菌的研究中，多糖的研究占主導(dǎo)地位，與其相對(duì)應(yīng)的小分子部分也不容忽視，馮天保等［6-7］利用HPLC對(duì)中國(guó)被毛孢菌水溶性小分子進(jìn)行構(gòu)建指紋圖譜，并描繪出該菌絲體水溶性小分子的特征譜圖，認(rèn)為該指紋分析可作為品質(zhì)分析以及部分藥用真菌小分子相似度分析的方法。本文旨在對(duì)小刺猴頭菌水溶性小分子的復(fù)雜成分進(jìn)行定量定性分析提供依據(jù)，通過(guò)對(duì)小刺猴頭菌及其同屬的猴頭菌菌絲體水溶性小分子指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比最終描述出小刺猴頭菌水溶性小分子提取物的色譜特征，說(shuō)明水溶性小分子可以反映出小刺猴頭菌的色譜特征，也可較好的反映出這8個(gè)發(fā)酵時(shí)期的水溶性小分子的相似關(guān)系，希望該方法能夠作為作為區(qū)分不同種真菌的方法，也希望該法可作為部分藥用真菌水溶性小分子指紋分析和品質(zhì)控制的候選方法。

［1］王曉玉，蔣秋燕，凌沛學(xué)，等.猴頭菌活性成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(1):70-72.

［2］張 松，徐章蔭.多糖類(lèi)醫(yī)藥生物活性進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，1996，17(6):272-275.

［3］曹瑞敏，王志才，苗人培，等.猴頭菌中部分脂肪酸和微量元素分析［J］白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996(3):243-244.

［4］崔建國(guó)，黃燕敏，何小玉，等.多羥基甾醇的合成(Ⅳ):20-亞甲基-4-孕烯-3β，6β-二醇的制備及其抗腫瘤活性研究［J］.廣西科學(xué)，2004(1):45-48.

［5］謝培山.中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術(shù)與應(yīng)用［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，26(10):653-655.

［6］馮天保.中國(guó)被毛孢菌絲體水提物質(zhì)量分析與控制方法研究［D］.上海:上海師范大學(xué)，2009.

［7］馮天保，楊曉彤，糜 可，等.藥用真菌子實(shí)體多糖SEC-HPLC圖譜的相似度定量評(píng)價(jià)研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9(7):201-204.