易 喻，汪竹環(huán)，朱克寅，李 敏，應(yīng)國清

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014;2.杭州博林生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310018)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種廣譜性抗生素，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有很好的抑制作用［1］。由于其優(yōu)良的抗菌性和低廉的價格，因此常作為細菌性疾病的治療藥物應(yīng)用于人和動物，并作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和人工水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但是，CAP具有毒性，易引起人體血中毒，長期應(yīng)用可導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細胞缺乏癥。嬰兒長期食用CAP污染的乳汁，可能會引起“灰嬰綜合征”［2-3］。此外長期微量攝入CAP，不僅使大腸桿菌、沙門氏菌等產(chǎn)生耐藥性，而且會引起機體正常菌群失調(diào)，使人們易感染各種疾?。?］。如果CAP在食用動物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，對人類的健康造成危害，因此，抗CAP單克隆抗體的制備對動物性食品中CAP的檢測具有重要意義。本研究以純化的CAP全抗原為免疫原，利用淋巴細胞融合技術(shù)，建立了能穩(wěn)定分泌特異性抗CAP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并對得到的單克隆抗體進行了純化和鑒定，為動物性食品中 CAP的檢測提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

SP2/0骨髓瘤細胞，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

CAP，上海晶純試劑有限公司;HAT培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液、PEG1500，Sigma公司;胎牛血清，民海生物工程有限公司;牛血清白蛋白(BSA)，上海生工生物工程有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;免疫原CAP-BSA和檢測抗原CAPOVA，本實驗室合成;羊抗小鼠 IgG-HRP，博士德生物工程有限公司。

BALB/c小鼠，浙江省動物實驗中心，許可證:SCXK(滬)2008-0016;F1小鼠，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證:SCXK(滬)2007-0005。

2 方法

2.1 免疫

用純化的CAP-BSA抗原淋巴注射6～8周齡的BALB/c小鼠，每次免疫量為100μg/只，第1次免疫與等量的弗式完全佐劑充分乳化，第2和第3次免疫與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化，每次間隔7d，融合前3 d腹腔直接注射抗原100μg加強免疫。

2.2 細胞融合

將小鼠處死，無菌摘取脾臟，研磨制取脾B淋巴細胞懸液，洗滌調(diào)整細胞濃度為(1～5)×107/mL。將免疫脾B淋巴細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞按 5∶1混合后離心棄上清，緩慢加入50%PEG1500溶液1mL，間隔1 min后，緩慢滴入無血清培養(yǎng)液，終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑后加入所需量的細胞培養(yǎng)液，分種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。

2.3 雜交瘤細胞的篩選

在選擇HAT培養(yǎng)基中，骨髓瘤細胞是不能生長的，而只有骨髓瘤細胞與B淋巴細胞的融合細胞能增殖生長;此外，正常B淋巴細胞一般在培養(yǎng)情況下也是不能長期存活，因而被淘汰。在細胞融合24 h后，每孔加入HAT培養(yǎng)液，每3 d換液1/2 HAT選擇培養(yǎng)液，經(jīng)過2周的培養(yǎng)后，骨髓瘤細胞與B淋巴細胞的雜交瘤細胞即被選擇培養(yǎng)出，然后進行單克隆化。

采用有限稀釋法進行細胞單克隆化，按實驗室常規(guī)方法操作，一般3～4次，直至克隆細胞生長的各個孔檢測100%抗體陽性為止。

2.4 單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的鑒定

采取體內(nèi)誘生法制備大量腹水。先腹腔注射液體石蠟0.5mL于F1小鼠，1周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10 d后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多，收集腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。

間接競爭ELISA(ciELISA)篩選雜交瘤細胞。用包被液將CAP-OVA抗原稀釋成一定濃度，1μg/孔包被酶標(biāo)板，設(shè)置空白對照孔，37℃包被2 h;PBS-T溶液浸洗3次，每孔加入細胞上清液200μL，37℃孵育1 h;PBS-T溶液浸洗3次，每孔加入用BSA溶液按 1∶3 000稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP 100μL，37℃孵育1 h;PBS-T溶液浸洗3次，雙蒸水浸洗3次，每孔加入鄰苯二胺底物溶液100μL，置于暗處反應(yīng)5 min，陽性孔變?yōu)樽攸S色，每孔加入2 mol/L H2SO4溶液100μL終止反應(yīng)。篩選出的陽性孔再用CAP-OVA包被的酶標(biāo)板進行競爭抑制性ELISA法，先將細胞培養(yǎng)上清與2×10－3mol/L的CAP溶液等量混合，37℃作用1 h，再加入已包被的酶標(biāo)板中。同時用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS替代CAP溶液作對照。若經(jīng)抑制后的A490降至對照孔50%以下，則判為陽性孔。

2.5 抗體的純化

選擇5mL HiTrap r-Protein A FF預(yù)裝色譜柱純化抗體。20mmol/L磷酸緩沖液上樣，用0.1 mol/L甘氨酸緩沖液洗脫?？疾爝x擇上樣緩沖液的pH和NaCl濃度、洗脫液的pH對抗體純化的影響［5］。

SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度和回收率。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，還原狀態(tài)下處理樣品，電泳后以考馬斯亮藍R250染色，乙醇乙酸脫色，直至背景脫凈為止，然后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析，鑒定其純度和回收率。

2.6 單克隆抗體特異性的測定

用ciELISA法測定純化后抗體與BSA、甲砜霉素以及磺二甲基嘧啶之間的交叉反應(yīng)，用BSA、甲砜霉素、磺二甲基嘧啶等稀釋液替代CAP稀釋液，其他條件相同。以50%抑制的CAP濃度與50%抑制的類似物濃度之比為其交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率=(50%抑制的CAP濃度/50%抑制的類似物濃度)×100%。交叉反應(yīng)率的大小了反應(yīng)了抗氯霉素單克隆抗體的特異性［6］。

3 結(jié)果

3.1 雜交瘤細胞株的建立

3.1.1 小鼠血清抗體效價檢測 CAP-BSA抗原免疫的BALB/c小鼠共4只，眼眶取血檢測效價(表1)。4只小鼠的血清抗體效價都達到了10－6以上，免疫效果較好，可進行細胞融合。

表1 免疫小鼠血清抗體效價Tab.1 Antibody titers in the sera of the mice immunized with CAP-BSA

3.1.2 雜交瘤細胞株的建立 細胞融合后經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后以及間接ELISA檢測，測出9個陽性孔，取上清效價最高(10－4)的兩孔細胞株(1D1，3G12)采用有限稀釋法單克隆化4次，從表2看出，第2，3，4次單克隆時，2株細胞的陽性率均為100%。雜交瘤細胞株經(jīng)14周的培養(yǎng)后依舊能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。經(jīng)液氮凍存、復(fù)蘇后，兩株細胞系仍能穩(wěn)定分泌特異性抗CAP抗體。

表2 2株雜交瘤細胞株單克隆化實驗結(jié)果Tab.2 Result of hybridoma cell cloning of 2 hybridoma cells

3.2 單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的鑒定

3.2.1 雜交瘤細胞上清蛋白含量及抗體效價的檢測 細胞上清抗體效價達到了10－4以上(表3)。

3.2.2 腹水蛋白含量及抗體效價的檢測 2株雜交瘤細胞株注射小鼠腹腔均能產(chǎn)生較高濃度的蛋白，且抗體效價均在10－7以上(表3)。

3.3 抗體的純化

在上樣緩沖液pH 6.5，7.0，7.5 條件下，單抗均能保留在色譜介質(zhì)上。在pH 7.0的上樣條件下，洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少，而且抗體在中性條件下也最為穩(wěn)定，所以確定pH 7.0為上樣的最佳pH。

上樣緩沖液中NaCl的濃度達4 mol/L以上時達到了其溶解度產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，從而影響抗體的穩(wěn)定性。當(dāng)NaCl濃度在0～3.0 mol/L時，目的單抗均能較好地與色譜介質(zhì)結(jié)合，在NaCl濃度為3.0 mol/L時，洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少，純度較高。

表3 細胞上清和腹水中的蛋白含量及抗體效價Tab.3 Protein concentration and antibody titer of cell culture supernate and obtained ascites

0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液作為洗脫液，進行一步洗脫。pH 值為2.5，3.0和3.5，實驗結(jié)果表明均能很好地將目的抗體與雜蛋白進行分離，隨著pH的增加，分辨率逐步提高，最后將抗體峰和雜蛋白峰徹底分開。目的抗體的純度大于95%。但隨著pH的增加，抗體的回收率也有所下降。因此，確定pH 3.0的0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液作為洗脫液。

本實驗確定pH 7.0，20 mmol/L磷酸緩沖液(含3.0 mol/L NaCl)為最佳上樣條件;pH 3.0，0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液為最佳洗脫條件。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析可知，抗體純度可以達到98%，回收率可達80%，抗體的生物學(xué)活性良好。色譜結(jié)果如圖1所示。電泳鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖1 mAb在r-Protein A親和色譜柱上色譜圖Fig.1 Chromatogram of mAb by using HiTrap r-Protein A FF

3.4 單克隆抗體特異性測定

采用ciELISA法測定交叉反應(yīng)結(jié)果見表4，表明單克隆抗體1D1和3G12與BSA、甲砜霉素以及磺二甲基嘧啶均無交叉反應(yīng)，這說明單克隆抗體1D1和3G12具有較高的特異性。

圖2 mAb在r-protein A親和色譜柱上純化電泳圖Fig.2 SDS-PAGEof mAb purified by using HiTrap r-Protein A FF

表4 單克隆抗體1D1和3G12的交叉反應(yīng)性Tab.4 Cross-reactivity(CR50%)of monoclonalantibody 1D1 and 3G12

4 討論

在制備CAP單克隆抗體的過程中，由于CAP(相對分子質(zhì)量為323)是一種半抗原，本身不具備免疫原性，所以需要將其與大分子載體物質(zhì)(蛋白質(zhì))相偶聯(lián)成完全抗原，免疫動物時才能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本文采用自制的CAP-BSA免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，經(jīng)反復(fù)篩選和單克隆化后得到了2株穩(wěn)定分泌單克隆抗體細胞株。而且交叉反應(yīng)結(jié)果表明所獲得的2株細胞分泌的單克隆抗體與BSA，甲砜霉素以及磺二甲基嘧啶均沒有交叉反應(yīng)性。CAP與BSA無交叉反應(yīng)，說明在免疫應(yīng)答反應(yīng)中只有CAP參與了免疫應(yīng)答反應(yīng)。而且CAP在結(jié)構(gòu)上和甲砜霉素的區(qū)別在于CAP的對位硝基被甲磺?；〈?，這進一步表明硝基在抗原-抗體反應(yīng)中的作用［7］。這將為為動物性食品中CAP殘留的檢測打下基礎(chǔ)。

本文采用重組蛋白A偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠作為親和介質(zhì)的蛋白A親和色譜純化小鼠腹水來源的抗CAP單克隆抗體，分離效果良好，獲得純度高，特異性強，生物活性好的單抗，并且操作簡便，快速，重復(fù)性好，色譜柱可反復(fù)多次使用，為今后單抗的純化提供了簡單、有效的方法。

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