覃斐章，簡(jiǎn) 潔，焦 楊，黃仁彬

(1.廣西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530021;2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

玉郎傘系豆科植物疏葉崖豆［Millettia pulchra(Dunn)Kurzvar.Laxior(Dunn)Z.Wei］的干燥根，為廣西壯族的習(xí)用藥材，用于治療高血壓、老年性癡呆，跌打損傷和風(fēng)濕、消化不良、產(chǎn)后及病后虛弱等［1］。本課題組對(duì)玉郎傘成分進(jìn)行了分離鑒定，從中篩選出一個(gè)具有較強(qiáng)抗氧化活性的新化合物［2］——17-甲 氧 基-7-羥 基-苯 并 呋 喃 查 爾 酮(YLSC)，已獲國(guó)家發(fā)明專利(200710034771.2)。我們初步的研究證實(shí)，YLSC具有較強(qiáng)的抗氧化、耐缺氧和抗凝血能力，對(duì)H2O2及缺氧復(fù)氧所致的心肌細(xì)胞損傷有較強(qiáng)的保護(hù)作用［3］，提示YLSC在抗心肌缺血方面有一定的潛力。為進(jìn)一步了解YLSC的藥理作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了YLSC對(duì)缺血再灌注(I/R)大鼠的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

YLSC(HPLC面積歸一法檢測(cè)純度為98%)，由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供;氯化三苯四氮唑(TTC)，Solarbio公司。

蛋白質(zhì)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所;細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，Roche公司;兔葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)多克隆抗體、兔caspase12多克隆抗體、鼠β-actin單克隆抗體，Santa Cruz Biotechnology;IgG-HRP、Immobilon-P試劑盒，Pierce公司。

動(dòng)物呼吸機(jī)器，上海奧爾科特生物科技有限公司;722s可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);Western電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重250～280 g，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(桂)2009-0002，試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(桂)2009-0004。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥方法

SD大鼠50只隨機(jī)分為5組(每組10只):假手術(shù)組、模型組、溶媒組、YLSC低劑量組、YLSC高劑量組。假手術(shù)組和模型組均給予生理鹽水;溶媒組給予含0.5%二甲基亞砜(DMSO)的生理鹽水;YLSC低劑量組和YLSC高劑量組分別給予YLSC 2.50 和5.00mg/kg，YLSC 溶液用含0.5%DMSO 的生理鹽水配制。各組均按2mL/kg尾靜脈注射給藥，1次/d，連續(xù)給藥7d。末次給藥后10 min復(fù)制大鼠I/R模型。

2.2 大鼠I/R模型的建立

20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠。行氣管插管，連接人工動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置參數(shù)為:呼吸頻率60～70次/min，潮氣量50mL/kg，呼吸比1∶2。四肢皮下插入針灸針，連接肢導(dǎo)聯(lián)，監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。自胸骨左緣第3，4肋間開(kāi)胸，放入淚囊牽張器撐開(kāi)兩側(cè)肋骨，以便心臟暴露良好。剪破心包膜，左手用眼科捏夾一小棉球，用棉球?qū)⑿叵偌白笮亩p輕向上推開(kāi)，于冠狀動(dòng)脈左前降支根部進(jìn)針穿5-0號(hào)縫合線(進(jìn)針深度約1 mm，寬度約1.5～2 mm)，備結(jié)扎用。缺血30 min再灌注60 min建立大鼠I/R模型，以左室前壁紫紺及ST段抬高，QRS幅度升高為結(jié)扎成功標(biāo)志，ST段逐漸降低，左室前壁缺血區(qū)紫紺消失為復(fù)灌成功標(biāo)志。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 血清CK、LDH、AST的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后心臟取血3mL，室溫靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液分裝，－20℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清CK、LDH、AST含量。

2.3.2 心肌梗死面積的測(cè)定再灌注結(jié)束后尾靜脈注射5mg/mL伊文斯藍(lán)1.5mL，30 min后打開(kāi)胸腔，取出心臟，生理鹽水充分洗凈殘血，濾紙吸干，剪去血管、結(jié)締組織、心房和右心室，留下左心室。將左心室置于－20℃冰箱冷凍30 min，平行房室溝將其切成5～8片，每片厚1～2 mm。切片置于1%TTC中37℃孵育15 min，正常心肌組織染成藍(lán)色，缺血心肌組織染成紅色，梗死心肌組織不染色呈白色。將切片展開(kāi)平鋪于載玻片上，數(shù)碼相機(jī)拍照，用病理圖像分析軟件計(jì)算梗死區(qū)總面積占缺血區(qū)總面積的百分比(infact size/area at risk zone，IS/AAR)。

2.3.3 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率 用TUNEL法檢測(cè)心肌凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況。將每個(gè)心臟標(biāo)本切為5片，每片取5個(gè)陽(yáng)性視野，即每個(gè)標(biāo)本計(jì)25個(gè)視野。正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，平均計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為細(xì)胞凋亡率。

2.3.4 Western blot法檢測(cè)蛋白GRP78、caspase12的表達(dá) 抽提組織蛋白，Bradford法計(jì)算蛋白含量。取樣品100μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入相應(yīng)稀釋倍數(shù)的一抗(GRP78、caspase12 的抗體體積比分別為1∶1 000，1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜。TTBS洗膜3次后加入相應(yīng)的二抗工作液(兔抗羊IgG體積比為1∶1 000，馬抗鼠IgG體積比為1∶2 000)，室溫孵育2 h，Immobilon-P試劑盒顯影成像。用Quantity One軟件分析蛋白條帶的吸光度值，以目的條帶的吸光度值/內(nèi)參β-actin的吸光度值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 YLSC對(duì)大鼠血清CK、LDH、AST含量的影響

由表1可知，與假手術(shù)組相比，模型組可以顯著升高大鼠血清CK、LDH、AST的含量(P＜0.01);與模型組比較，YLSC可以減少 I/R大鼠心肌 CK、LDH、AST的漏出(P＜0.05或 P＜0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系。

表1 YLSC對(duì)大鼠血清CK、LDH、AST含量的影響(n=10，±s)Tab.1 Effects of YLSC on contents of CK，LDH and AST in serum(n=10，±s)

表1 YLSC對(duì)大鼠血清CK、LDH、AST含量的影響(n=10，±s)Tab.1 Effects of YLSC on contents of CK，LDH and AST in serum(n=10，±s)

與假手術(shù)組比較:1 P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.05，3 P＜0.01 1 P＜0.01 vs sham group;2 P＜0.05，3 P＜0.01 vs model group

組 別 劑量/(mg/kg) CK/(u/L) LDH/(u/L) AST/(u/L)假手術(shù)組 －13.57±1.44 2308.7±270.4 285.6±39.2模型組 － 16.73±1.721 4516.3±572.61 958.6±102.71溶媒組 － 16.54±1.581 4538.9±453.01 1025.8±115.41 YLSC 低劑量組 2.50 14.66±1.552 3724.5±412.81，2 813.0±76.51，2 YLSC 高劑量組 5.00 14.27±1.532 3541.2±380.31，3 754.1±66.81，3

3.2 YLSC對(duì)I/R大鼠心肌梗死面積的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。與模型組比較，YLSC可明顯降低I/R 大鼠的IS/AAR(P＜0.01)。

3.3 YLSC對(duì)I/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的影響

結(jié)果見(jiàn)表2，圖1。

陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞核邊集，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞體積變小;正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色。假手術(shù)組僅見(jiàn)個(gè)別散在的凋亡細(xì)胞;模型組假手術(shù)組比較，凋亡細(xì)胞明顯增加(P＜0.01);YLSC可以劑量依賴性的減少I(mǎi)/R大鼠的細(xì)胞凋亡率(與模型組比較:P＜0.01)。

表2 YLSC對(duì)I/R大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of YLSC on infact size and apoptosis rate in rats with I/R injury(n=10，±s)

表2 YLSC對(duì)I/R大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡率的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of YLSC on infact size and apoptosis rate in rats with I/R injury(n=10，±s)

與假手術(shù)組比較:1 P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.011 P＜0.01 vs sham group;2 P＜0.01 vs model group

組 別 劑量/(mg/kg)(IS/AAR)/%凋亡率/%假手術(shù)組 － 15.4±1.8 1.5±0.2模型組 － 31.0±2.91 40.1±4.31溶媒組 － 30.5±3.21 38.8±2.51 YLSC 低劑量組 2.50 24.1±2.51，2 25.4±1.71，2 YLSC 高劑量組 5.00 20.3±2.41，2 26.3±4.61，2

圖1 假手術(shù)組(A)、模型組(B)、溶媒組(C)、YLSC低劑量組(D)和YLSC高劑量組(E)大鼠心肌心肌細(xì)胞凋亡率變化(TUNEL法，×400)Fig.1 Comparison of apoptosis level in sham group(A)，I/R group(B)，vehicle group(C)，YLSC 2.50mg/kg group(D)and YLSC 5.00mg/kg group(E)(TUNEL，×400)

3.4 YLSC對(duì)心肌GRP78和caspase12表達(dá)的影響

結(jié)果見(jiàn)圖2。與假手術(shù)組比較，模型組GRP78和caspase12表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，給予 YLSC后，GRP78和caspase12表達(dá)量明顯減少，且呈劑量依賴性(與模型組比較:P＜0.05或P＜0.01)。

4 討論

心肌缺氧時(shí)，氧自由基生成，能量代謝障礙，使心功能受損。再灌注后活性氧大量生成，炎癥介質(zhì)釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，使細(xì)胞膜損傷，完整性喪失，通透性增加，心肌酶漏出。心肌酶釋放的多少可以作為心肌損傷的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一。另有研究認(rèn)為，心肌梗死范圍的大小可以作為評(píng)價(jià)藥物心肌保護(hù)作用的金指標(biāo)［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用YLSC后，大量存在于心肌細(xì)胞中的CK、LDH、AST的漏出減少，心肌梗死面積減少，表明YLSC可減輕I/R所致的心肌細(xì)胞損傷，對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是分泌蛋白和膜蛋白的重要合成場(chǎng)所［5］。干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，可使蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊，未折疊蛋白(unfolded protein response，UPR)在腔內(nèi)聚集，Ca2+平衡紊亂，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。UPR的目的是維持細(xì)胞內(nèi)的平衡，但激烈和持續(xù)的ERS能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。許多研究發(fā)現(xiàn)，I/R介導(dǎo)了ERS。大鼠心肌I/R模型［7］、H9c2細(xì)胞［8］、乳鼠心肌細(xì)胞［9］等均發(fā)現(xiàn)，I/R(或缺氧復(fù)氧處理)可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78、caspase12等被特異性的激活，表達(dá)增多，活性上調(diào)，表明ERS在I/R的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激蛋白，屬熱休克蛋白70家族中的一員，序列高度保守。機(jī)體缺氧時(shí)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力下降，蛋白合成遭到破壞，最終損傷細(xì)胞。GRP78可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊的或錯(cuò)誤折疊的蛋白結(jié)合，從而使與GRP78結(jié)合的3個(gè)UPR的敏感受體IRE1(the inositol-requiring enzyme l)、PERK(the PKR-like ER kinase)、ATF6(the activating transcription factor 6)從GRP78復(fù)合物中解離出來(lái)，引發(fā)UPR，促使機(jī)體對(duì)ERS作出反應(yīng)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡的狀態(tài)。故GRP78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的“中心調(diào)節(jié)劑”，GRP78表達(dá)上調(diào)是ERS的標(biāo)志之一［10］。caspase12在ERS時(shí)被特異性的激活［11］，為ERS的標(biāo)志因子，死亡受體途徑和線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均不引起caspase12活化。caspase12激活后裂解為caspase3等下游效應(yīng)蛋白，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，促發(fā)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，I/R誘導(dǎo)的大鼠細(xì)胞凋亡率明顯增加，GRP78和caspase12表達(dá)明顯增加，給予YLSC后，上述指標(biāo)得到不同程度的改善，并呈一定的劑量依賴性。表明YLSC可以減輕 I/R誘導(dǎo)的ERS，減少心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，I/R可破壞心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡，心肌酶漏出，促使 ERS蛋白GRP78、caspase12表達(dá)。YLSC能保護(hù)心肌細(xì)胞，對(duì)抗I/R引起的損傷，其心肌保護(hù)作用可能與抑制ERS蛋白GRP78、caspase12的表達(dá)有關(guān)。

圖2 YLSC對(duì)心肌蛋白GRP78和caspase12表達(dá)的影響(n=10，±s)Fig.2 Effect of YLSC on expression of GRP78 and caspase12 in cardiac myocytes(n=10，±s)

［1］廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］.南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992:31-32.

［2］簡(jiǎn) 潔，張士軍，邱 莉，等.壯藥玉郎傘查爾酮類成分的研究［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(20):1734-1737.

［3］簡(jiǎn) 潔.玉郎傘黃酮成分的單體分離與藥效研究［D］.南寧:廣西醫(yī)科大學(xué)，2009.

［4］Naderi R，Imani A，F(xiàn)aqhihi M，etal.Phenylephrine induces early and late cardioprotection through mitochondrial permeability transition pore in the isolated rat heart［J］.J Surg Res，2010，164(1):e37-e42.

［5］Ron D.Translational control in the endoplasmic reticulum stress response［J］.J Clin Invest，2002，110:1383-1388.

［6］Ferri K F，Kroemer G.Organelle-specific initiation of cell death pathways［J］.Nat Cell Biol，2001，3:255-263.

［7］Wang Xinbao，Huang Xiaomei，Ochs T，etal.Effect of sulfur dioxide preconditioning on rat myocardial ischemia/reperfusion injury by inducing endoplasmic reticulum stress［J］.Basic Res Cardiol，2011，106:865-878.

［8］Zhang P L，Lun Mingyue，Teng Jiamin，etal.Preinduced molecular chaperones in the endoplasmic reticulum product cardiomyocytes from lethal injury［J］.Ann Clin Lab Sci，2004，34(4):449-456.

［9］馬青變，高 煒，郭艷紅，等.缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2005，37(4):386-388.

［10］Lee A S.Mammalian stress response induction of the glucose-regulated protein family［J］.Curr Opin Cell Biol，1992，4(2):267-273.

［11］胡國(guó)梁，何昆侖，范 利，等.衣霉素誘導(dǎo)乳鼠原代心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31(3):260.