金麗琴，劉明達(dá)，呂建新，陳秀芳，錢 松

(溫州醫(yī)學(xué)院 1.基礎(chǔ)學(xué)院 生化教研室，2.附屬第一人民醫(yī)院 第八院區(qū)，3.檢驗(yàn)與生命科學(xué)院，4.藥學(xué)院，浙江 溫州 325035)

黑米(black rice)是重要的優(yōu)異稻種資源，有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的功能成分。其主要的活性成分黑米花色素苷(black rice anthocyanin，BA)是一類多酚類黃酮化合物。BA有抗氧化、清除自由基、保護(hù)心血管及抗腫瘤等作用［1-5］。目前，BA在活體組織中免疫活性研究報(bào)道較少，對(duì)機(jī)體器官組織的免疫調(diào)節(jié)功能及抗氧化作用未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從免疫學(xué)和生物化學(xué)的角度觀察BA對(duì)大鼠組織器官中乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)等主要免疫和抗氧化生化指標(biāo)的影響，探討B(tài)A對(duì)大鼠組織器官的免疫調(diào)節(jié)功能及抗氧化作用，進(jìn)而為推動(dòng)開(kāi)發(fā)BA作為營(yíng)養(yǎng)保健食品資源和臨床輔助藥用資源提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibeco公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;AmberliteXAD-7大孔吸附樹(shù)脂，上海羅門哈斯公司;LDH、ACP、AKP、SOD及MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所。

雌性SPF級(jí)SD大鼠24只，10～12周齡，體重(170±15)g，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(浙)2003-0001。

LGJ0.5冷凍干燥器，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;U-niversal 32R低溫離心機(jī)，德國(guó);光譜掃描功能讀數(shù)儀，芬蘭 Thermo Scientific。

2 方法

2.1 BA 的制備

選取外被色深黑粳米，經(jīng)碾米機(jī)過(guò)40目篩，制成黑米粉，加浸提液(含1.0%檸檬酸，60%乙醇)，水浴浸提，超聲輔助，重復(fù)2次，減壓濃縮，Amberlite XAD-7大孔吸附樹(shù)脂吸附，80%乙醇洗脫，真空抽濾去雜;減壓濃縮，經(jīng)冷凍干燥得粉末狀BA［6］。采用高效液相色譜法(峰面積歸一法)測(cè)得總花色素苷含量為37.69%。

2.2 動(dòng)物分組與處理

雌性SPF級(jí)SD大鼠24只隨機(jī)均分為4組:對(duì)照組(生理鹽水，2mL/kg);BA低劑量組(BA 25mg/kg);BA中劑量組(BA 50mg/kg);BA高劑量組(BA 100mg/kg)。每天在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，給大鼠稱重，并按大鼠體重灌胃1次，連續(xù)給藥30 d。大鼠股動(dòng)脈放血處死后，剝?nèi)〈笫蟮男叵佟⑵?、肝和腎等臟器，稱其濕重，以各臟器濕重除以大鼠體重，得濕重指數(shù)。

2.3 組織勻漿制備

將剝?nèi)〉母?、腎、脾、胸腺組織用生理鹽水洗去血污后，用濾紙吸干。每個(gè)臟器各取2份，每份0.2 g。用勻漿介質(zhì)研磨成組織勻漿(200mg/mL)，于4℃，13 000 r/min離心10 min，取上清置1mL EP管內(nèi)保存于－20℃待測(cè)。

2.4 生化指標(biāo)的測(cè)定

LDH活力、ACP活力、SOD活力、GSH活力以及MDA含量的測(cè)定均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作［7-8］。

2.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 BA對(duì)大鼠的胸腺、脾、肝和腎濕重指數(shù)的影響

結(jié)果見(jiàn)表1。BA能使大鼠胸腺濕重指數(shù)顯著增加(P＜0.05);BA高劑量組大鼠肝臟濕重指數(shù)顯著提高(P＜0.05)。BA對(duì)脾、腎濕重指數(shù)無(wú)顯著影響。

3.2 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中LDH的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，BA使大鼠脾、肝和腎內(nèi)的LDH活力顯著升高(P＜0.05或0.01)，但對(duì)胸腺內(nèi)的LDH活力無(wú)顯著影響。

表1 BA對(duì)大鼠的胸腺、脾、肝和腎濕重指數(shù)的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of black rice on the wet weight index of thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表1 BA對(duì)大鼠的胸腺、脾、肝和腎濕重指數(shù)的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of black rice on the wet weight index of thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

與對(duì)照組比較: 1P＜ 0. 051P＜ 0. 05 vs control group

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表2 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中LDH的影響(±s，n=6)Tab.2 The effects of black rice anthocyanin on the LDH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表2 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中LDH的影響(±s，n=6)Tab.2 The effects of black rice anthocyanin on the LDH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

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3.3 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中ACP的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。BA使大鼠脾、肝和腎內(nèi)的ACP活力顯著升高(P＜0.05或0.01)。

3.4 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中SOD的影響

結(jié)果見(jiàn)表4。BA組大鼠胸腺、脾、肝中SOD活力都有不同程度的升高(P＜0.05或＜0.01)，但對(duì)腎中SOD活力無(wú)顯著影響。

3.5 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中MDA的影響

結(jié)果見(jiàn)表5。BA組大鼠的胸腺、脾中MDA水平都有不同程度的降低(P＜0.05或0.01)，但對(duì)肝、腎組織中MDA水平無(wú)顯著影響。

3.6 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中GSH的影響

結(jié)果見(jiàn)表6。BA組大鼠脾、肝、腎中GSH水平都有不同程度的升高(P＜0.05或＜0.01)。

表3 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中ACP的影響(±s，n=6)Tab.3 The effects of black rice anthocyanin on the ACP activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表3 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中ACP的影響(±s，n=6)Tab.3 The effects of black rice anthocyanin on the ACP activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

組 別 ACP/(u/100mL)胸腺 脾 肝 腎對(duì)照組BA低劑量組BA中劑量組BA高劑量組611.6±39.6 581.7±99.6 689.9±123.1 823.7±92.72 615.2±51.9 748.9±79.91 746.5±86.61 788.4±73.62 184.5±18.9 250.9±38.52 347.6±37.72 344.0±54.92 466.8±50.8 665.2±102.42 789.2±68.52 785.2±93.02

表4 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中SOD的影響(±s，n=6)Tab.4 The effects of black rice anthocyanin on the SOD activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表4 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中SOD的影響(±s，n=6)Tab.4 The effects of black rice anthocyanin on the SOD activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

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表5 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中MDA的影響(±s，n=6)Tab.5 The effects of black rice anthocyanin on the MDA activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表5 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中MDA的影響(±s，n=6)Tab.5 The effects of black rice anthocyanin on the MDA activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

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表6 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中GSH的影響結(jié)果(±s，n=6)Tab.6 The effects of black rice anthocyanin on the GSH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表6 BA對(duì)大鼠胸腺、脾、肝、腎組織中GSH的影響結(jié)果(±s，n=6)Tab.6 The effects of black rice anthocyanin on the GSH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

組 別 GSH/(mg/mL)胸腺 脾 肝 腎對(duì)照組BA低劑量組BA中劑量組BA高劑量組20.36±1.46 19.15±2.87 23.23±3.14 22.65±4.18 7.86±1.45 14.67±2.582 13.71±2.762 14.53±1.372 2.18±0.54 3.33±0.651 5.27±0.992 4.83±0.992 9.15±2.35 12.58±3.151 13.38±2.941 13.33±1.841

4 討論

胸腺屬于中樞免疫器官，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞成熟，在建立自身免疫耐受和維持免疫自穩(wěn)方面發(fā)揮重要作用。脾臟屬于外周免疫器官，也具有重要的免疫功能［9］。有學(xué)者認(rèn)為胸腺和脾臟重量指數(shù)的改變能夠反映機(jī)體免疫功能的狀態(tài)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量BA均能使大鼠胸腺和脾臟濕重指數(shù)顯著提高，表明BA可促進(jìn)脾臟、胸腺組織細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，改善機(jī)體的免疫功能。

ACP、LDH是巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志酶，其活性隨著巨噬細(xì)胞激活而升高，并隨著巨噬細(xì)胞的抑制而降低［12-13］。LDH還是細(xì)胞內(nèi)葡萄糖酵解所必需的酶，LDH活性的增強(qiáng)可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的酵解，為組織細(xì)胞活動(dòng)以及巨噬細(xì)胞的吞噬過(guò)程提供相應(yīng)能量，同時(shí)酵解過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸使巨噬細(xì)胞內(nèi)pH下降，有利于巨噬細(xì)胞殺菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量BA均能使大鼠肝、腎、脾、胸腺等臟器組織中的ACP、LDH活力顯著升高，表明BA可增強(qiáng)肝、腎、脾、胸腺等臟器組織的殺菌能力，提高免疫功能。

SOD是超氧自由基清除的關(guān)鍵酶，其活性的變化反映了機(jī)體氧化損傷的狀況。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑，也是抵御自由基損害的重要物質(zhì)。GSH可清除H2O2，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化的連鎖反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整。當(dāng)GSH水平下降時(shí)，消弱了對(duì)自由基損害的防御能力，從而加速了自由基對(duì)細(xì)胞生物膜系統(tǒng)不飽和脂肪酸的氧化。MDA是生物膜中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量隨著氧化損傷以及衰老進(jìn)程的增加而增加，作為組織損傷的一種指標(biāo)而被廣泛應(yīng)用于抗氧化研究［14］。

本實(shí)驗(yàn)中，不同劑量的BA使大鼠肝、脾和(或)胸腺、腎組織中SOD和GSH水平升高，并使胸腺組織中MDA水平下降。表明BA是一種良好的自由基清除劑和(或)抑制劑。BA通過(guò)清除組織器官內(nèi)自由基，維護(hù)臟器功能，達(dá)到延緩組織器官衰老的作用。由于抗氧化作用(抗衰老)與促免疫調(diào)節(jié)作用互為因果關(guān)系，即抗氧化能力增強(qiáng)了，免疫功能也提高了，反之，免疫功能提高了，抗氧化能力也增強(qiáng)了，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BA既有抗氧化作用(抗衰老)又有促免疫調(diào)節(jié)功能，是與理論分析相符的。

綜上所述，BA對(duì)機(jī)體重要組織器官有良好的保護(hù)作用，能增強(qiáng)組織免疫能力，具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能和抗氧化作用，可以作為機(jī)體一種良好的食用和輔助藥用的免疫調(diào)節(jié)劑或抗氧化劑。

BA中成分復(fù)雜，其中有效活性物質(zhì)以及作用機(jī)制、靶點(diǎn)途徑和體內(nèi)的代謝情況、生物利用度、影響生物活性多因素分析等均有待進(jìn)一步深入研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)未能反映出BA對(duì)組織器官免疫功能調(diào)節(jié)作用和抗氧化功能的劑量效應(yīng)，這也有待進(jìn)一步研究。

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