周興軍，宋 欣，李立敏，董向鋒，董愛(ài)華，2

(1.華北制藥集團(tuán) 新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，2.微生物藥物國(guó)家工程研究中心，河北 石家莊 050015)

乙型肝炎(乙肝)病毒感染是引起慢性肝病的主要病因，并常導(dǎo)致肝硬化及肝癌。它是一種胞內(nèi)寄生物，它的清除與機(jī)體的細(xì)胞免疫有關(guān)，尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和Th1細(xì)胞因子的分泌。研究表明慢性乙肝患者與自限性乙肝相比較，特異性的CTL反應(yīng)，Th細(xì)胞反應(yīng)，Th細(xì)胞和Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)均明顯低下，針對(duì)核心抗原的特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞與慢性HBV感染的消除有關(guān)。利用疫苗治療慢性乙肝病毒感染的作用機(jī)制是通過(guò)對(duì)抗原的改造和(或)抗原遞呈途經(jīng)的改變，使得T細(xì)胞更易識(shí)別抗原，促使前體T細(xì)胞增殖分化成效應(yīng)T細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)［1］。所以，增強(qiáng)乙肝疫苗的細(xì)胞免疫功能，有助于清除病毒感染的細(xì)胞，避免持續(xù)感染引起的慢性病變。本文著重探討粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Gm-csf)與基因工程乙肝疫苗協(xié)同誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞的免疫應(yīng)答，為臨床采用乙肝疫苗作為治療措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

BALB/c小鼠，SPF級(jí)，雌性，體重16～18 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào):SCXK(京)2002-0003。

重組(CHO細(xì)胞)乙肝疫苗［Recombinant Hepatitis B Vaccine(Chinese Hamster Overy)］(10 μg/mL)、注射用重組人 Gm-csf［Recombinant Human Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor for Injection］(rhGm-csf)(300 μg/支)、CHO 細(xì)胞表達(dá)的基因工程乙肝疫苗原液(HBsAg原液)，均由華北制藥集團(tuán)金坦生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn);乙肝病毒表面抗體酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司。

IFN-γ、和IL-5的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，上海雄森科技實(shí)業(yè)有限公司;抗HBs用“乙型肝炎病毒表面抗體酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒”，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司;MTT、SDS、HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG1、IgG2a均購(gòu)自Sigma公司。

2 方法

2.1 脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞因子含量的測(cè)定

將BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組5只。原液組:給予乙肝疫苗原液2μg/只;疫苗組:給予乙肝疫苗2μg/只;混合疫苗組:給予乙肝疫苗2μg/只，同時(shí)給予rhGm-csf 20μg/只;GM+疫苗組:給予乙肝疫苗2μg/只的前3 d，連續(xù)3 d給予rhGm-csf 20μg/d。分別在第0，14天免疫兩次，并在第21天眼眶放血處死。常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用含15%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入脾細(xì)胞懸液100μL和含HBsAg原液(10μg/mL)的完全培養(yǎng)基100μL，陰性對(duì)照孔用完全培養(yǎng)基代替。在37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后，每孔各取脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液100μL，用小鼠IFN-γ和IL-5的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子含量;剩余細(xì)胞采用MTT 法［2］，每孔加入MTT(5mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，每孔再加入10%SDS 100μL，置37℃，濕盒中過(guò)夜，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570 nm/630 nm波長(zhǎng)下讀取各孔A值，檢測(cè)脾細(xì)胞的增殖程度，即刺激指數(shù)。刺激指數(shù)=(A實(shí)驗(yàn)/A陰性對(duì)照)×100%。

2.2 HBsAg特異性CTL活性的測(cè)定

2.2.1 HBsAg特異性CTL效應(yīng)細(xì)胞制備 分組及給藥同2.1項(xiàng)。常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用含15%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。

2.2.2 靶細(xì)胞制備 取培養(yǎng)24～48 h的靶細(xì)胞YAC-1，用完全培養(yǎng)基洗滌2次，再調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL。

2.2.3 CTL活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)組為效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞各100μL加入96孔板中，自然釋放組以同體積的完全培養(yǎng)基代替效應(yīng)細(xì)胞，空白對(duì)照組以同體積的完全培養(yǎng)液代替靶細(xì)胞，每份標(biāo)本設(shè)3復(fù)孔，置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h后，吸取各孔上清100μL后，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，每孔加入10%SDS100μL，置37℃，濕盒中過(guò)夜，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570 nm/630 nm波長(zhǎng)下讀取各孔A值，以A值計(jì)算殺傷率。殺傷率(%)=［(A空白+A自然釋放－A實(shí)驗(yàn))/A自然釋放］×100%。

2.3 抗體IgG1、IgG2a亞型滴度檢測(cè)

將2.2項(xiàng)下的小鼠血清收集到離心管中，3 000 r/min離心 15 min，分離血清，檢測(cè)血清中抗體IgG1、IgG2a亞型滴度。用pH 9.6碳酸鹽緩沖液將CHO表達(dá)的HBsAg原液稀釋至2μg/mL，每孔100 μL包被在酶標(biāo)板上，4℃濕盒中過(guò)夜;次日，洗滌后加入按一定比例稀釋的小鼠血清，37℃培養(yǎng)1 h，洗板，然后每孔分別加入1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG1或IgG2a，37℃培養(yǎng)1 h，洗板，加顯色劑，37℃靜置10～15 min，加入1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm/630 nm波長(zhǎng)下讀取各孔A值。以空白對(duì)照作為陰性對(duì)照，A樣品/A陰性對(duì)照＞2.1判為陽(yáng)性，A陰性對(duì)照＜0.05按0.05 計(jì)算，高于0.05 按實(shí)際 A值計(jì)算，以出現(xiàn)陽(yáng)性最高稀釋度作為該樣品的滴度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

原液組、疫苗組、混合疫苗組和GM+疫苗組免疫效果用t檢驗(yàn)判斷有無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

GM+疫苗組小鼠脾細(xì)胞增殖速度最快，顯著性高于其它組(P＜0.01或0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 CTL 活性測(cè)定

GM+疫苗組小鼠脾細(xì)胞CTL活性均顯著高于其它組(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 脾細(xì)胞刺激指數(shù)及小鼠脾細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率(n=5，±s)Tab.1 The stimulation index and specific cytolytic activity of mice splenic lymphocytes in different groups(n=5，±s)

表1 脾細(xì)胞刺激指數(shù)及小鼠脾細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率(n=5，±s)Tab.1 The stimulation index and specific cytolytic activity of mice splenic lymphocytes in different groups(n=5，±s)

與GM+疫苗組相比:1 P＜0.01，2 P＜0.05Compared with the GM+Vaccine group:1 P＜0.01，2 P＜0.05

組 別 刺激指數(shù)/% 殺傷率/%原液組 14.8±9.61 30.406±13.2351疫苗組 20.5±10.82 38.328±15.1321混合疫苗組 25.1±9.52 39.232±21.1341 GM+疫苗組54.8±18.4 78.618±14.948

3.3 細(xì)胞因子

GM+疫苗組小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量較多，GM+疫苗組顯著高于疫苗組(P＜0.05);混合疫苗組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-5含量較多，故活化的Th2型T細(xì)胞，分泌IL-5細(xì)胞因子，參與激活B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-5含量(n=5，±s)Tab.2 The concentration of IFN-γand IL-5 of mice in splenic lymphocytes supernate(n=5，±s)

表2 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-5含量(n=5，±s)Tab.2 The concentration of IFN-γand IL-5 of mice in splenic lymphocytes supernate(n=5，±s)

與GM+疫苗組相比:1P＜0.05Compared with the GM+Vaccine group:1P＜0.05

組 別 IFN-γ 含量/(pg/mL)IL-5含量/(pg/mL)原液組0 9.067±0.146疫苗組 14.025±2.2881 14.133±0.278混合疫苗組 16.462±9.5041 16.133±0.231 GM+疫苗組32.501±11.713 13.367±0.155

3.4 抗體IgG1、IgG2a亞型滴度

GM+疫苗組小鼠血清抗體中IgG2a占優(yōu)勢(shì)，混合疫苗組小鼠血清抗體中以IgG1為主。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 抗體IgG1、IgG2a亞型滴度(n=5，±s)Tab.3 The total antibody titer of sera in mice after the once immunization(n=5，±s)

表3 抗體IgG1、IgG2a亞型滴度(n=5，±s)Tab.3 The total antibody titer of sera in mice after the once immunization(n=5，±s)

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4 討論

以往對(duì)乙肝疫苗效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)一般為測(cè)定抗體反應(yīng)，近年來(lái)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫受到人們的重視。乙肝表面抗原作為一種外源蛋白，不僅可使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，而且進(jìn)入機(jī)體后，可由抗原提呈細(xì)胞(APC)進(jìn)行酶解加工處理，生成的短肽與APC表面MHC分子形成復(fù)合物，呈遞給T細(xì)胞進(jìn)行激活，誘導(dǎo)CD8+抗原特異性的CTL產(chǎn)生，從而對(duì)胞內(nèi)病原體產(chǎn)生滅活作用［3］。

在乙肝免疫治療研究中，通常用以評(píng)價(jià)特異性細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)，有特異性CTL殺傷能力，刺激產(chǎn)生Th1類(lèi)細(xì)胞因子如IFN-γ的水平，特異性T細(xì)胞增殖能力，以及特異性IgG2a的水平等［4］。CTL特異性識(shí)別HBV感染的細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞裂解、非細(xì)胞裂解(如分泌細(xì)胞因子)途徑限制病毒傳播，或通過(guò)細(xì)胞病毒作用，清除感染病毒的細(xì)胞。Gm-csf是一個(gè)具有多項(xiàng)潛能的骨髓造血生長(zhǎng)因子，不僅能夠作用于造血干、祖細(xì)胞促進(jìn)骨髓造血，而且還作用于目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞——樹(shù)突狀細(xì)胞，以促進(jìn)免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［5］。

本研究結(jié)果顯示，提前3 d給予Gm-csf的GM+疫苗組小鼠機(jī)體的Th1/Th2免疫應(yīng)答發(fā)生的明顯變化，作為T(mén)h1樣細(xì)胞因子代表的IFN-γ的產(chǎn)量明顯增加，說(shuō)明在機(jī)體的免疫細(xì)胞被Gm-csf激活的同時(shí)，接收到乙肝疫苗的抗原刺激，會(huì)誘發(fā)更加迅速、有效的抗原提呈，增強(qiáng)了機(jī)體的Th1樣免疫應(yīng)答。以上初步研究結(jié)果表明Gm-csf有助于提高CHO來(lái)源的乙肝疫苗細(xì)胞免疫，提示在乙肝的治療方面可能會(huì)起到一定的作用。

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