劉 娟

(武漢科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

當(dāng)歸是我國(guó)的一味傳統(tǒng)中藥，具有活血補(bǔ)血、潤(rùn)腸調(diào)經(jīng)、扶正固本之功效，素有“十方九歸”之說(shuō)。從當(dāng)歸中提取的當(dāng)歸多糖(Angelica Sinensis polysaccharides，ASP)具有豐富的生物學(xué)活性，包括影響造血系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)胃潰瘍愈合等［1-4］。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，ASP對(duì)酒精所致的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用［5］。在此基礎(chǔ)上，我們從甘肅岷縣新鮮當(dāng)歸中提取分離出了多糖含量較高的ASP，進(jìn)一步觀察其對(duì)臨床常用的糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物地塞米松(dexamethasone，DEX)所致肝損傷是否亦具有干預(yù)作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料

當(dāng)歸購(gòu)于甘肅岷縣康達(dá)有限責(zé)任公司，經(jīng)水煮-醇沉法得當(dāng)歸粗多糖，經(jīng)Sevag法去蛋白，醇沉，冷凍干燥10 h，得ASP，為淺米灰色疏松狀粉末，測(cè)得其總糖含量為96.8%［6］。

地塞米松磷酸鈉注射液，武漢濱湖雙鶴藥業(yè)公司;異檸檬酸、異檸檬酸脫氫酶、氧化型輔酶Ⅱ(NADP)、還原型谷胱甘肽(GSH)、二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)，Sigma公司;血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(sALT)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(sAST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所;酶法葡萄糖測(cè)定試劑盒，上?？菩郎锛夹g(shù)研究所;胰島素放免測(cè)定試劑盒，北方生物技術(shù)研究所。

Himar CF15R低溫高速離心機(jī)，日本HITACH;UV-1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

昆明種小鼠，雄性，SPF級(jí)，體重20～22 g，湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):2003-0005。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組8只:空白對(duì)照組、DEX模型組、ASP小劑量組(100mg/kg)及大劑量組(200mg/kg)，灌胃給藥，ASP組給予相應(yīng)劑量的ASP，另兩組給予等體積生理鹽水，1次/d，共10 d。從第4天起，各組均皮下注射 DEX 12mg/kg，1次/d，共7d。末次給藥6 h后，斷頭處死動(dòng)物。

2.2 標(biāo)本制備

小鼠摘眼球取血，制備血清，置于－20℃保存。迅速剖腹取肝臟，置于冰冷生理鹽水中反復(fù)漂洗，濾紙吸干，稱(chēng)重。采用pH 7.4，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液制備肝勻漿。9 000 r/min離心20 min，取上清液，為小鼠肝臟S9組分，－80℃凍存。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)sALT、sAST及肝組織SOD、MDA含量。DTNB比色法測(cè)定肝組織GSH含量。GOD-PAP葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖。蒽酮法測(cè)定肝糖原含量。放射免疫法測(cè)定血清胰島素。Lowry法測(cè)定蛋白含量。以苯胺為底物，測(cè)定小鼠肝臟S9組分的苯胺羥化酶(ANH)以反映CYP2E1活性。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 ASP對(duì)小鼠sALT、sAST及肝臟指數(shù)的影響

結(jié)果見(jiàn)表1。DEX模型組小鼠sALT、sAST較空白對(duì)照組上升 270.4%及83.2%(P＜0.01)，肝臟指數(shù)明顯增大(P＜0.01)，反映了短期超大劑量使用DEX可產(chǎn)生明顯肝臟毒性。與模型組相比，ASP兩劑量組均可顯著抑制DEX所致小鼠sALT(分別降低23.1%和27.6%)及sAST水平(分別降低18.7%和30.1%)的上升幅度(P＜0.01);且肝臟指數(shù)的下降亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。這些結(jié)果表明，ASP對(duì)DEX所致肝毒有明顯的預(yù)防、保護(hù)作用，雖然大劑量(200mg/kg)比小劑量(100mg/kg)的干預(yù)能力似乎更突出，但兩者之間并未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 ASP對(duì)小鼠sALT、sAST及肝臟指數(shù)的影響(n=8，±s)Tab.1 Effects of ASP on activities of sALT，sAST and liver index in mice intoxicated with dexamethasone(n=8，±s)

表1 ASP對(duì)小鼠sALT、sAST及肝臟指數(shù)的影響(n=8，±s)Tab.1 Effects of ASP on activities of sALT，sAST and liver index in mice intoxicated with dexamethasone(n=8，±s)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.01;與模型組比較:2P＜0.05，3 P＜0.01Compared with control group:1 P＜0.01;Compared with modle group:2P＜0.05，3P＜0.01

組 別 劑量/(mg/kg) sALT/(u/L) sAST/(u/L) 肝臟指數(shù)/%空白對(duì)照組 －8.41±2.40 13.56±3.42 4.90±0.21 DEX模型組 － 31.32±9.101 24.84±4.041 5.63±0.401小劑量 ASP 組 100 24.09±3.822 20.19±3.383 5.05±0.302大劑量 ASP 組 200 22.68±3.163 17.37±3.033 4.78±0.193

3.2 ASP對(duì)小鼠肝 S9組分 SOD、GSH及MDA活性的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。ASP兩劑量組分別使明顯降低的SOD含量升高了17.8% 和20.1%(P＜0.05)。GSH水平亦較模型組有較大程度的恢復(fù)，其增幅分別高達(dá)10.9%和14.9%(P＜0.05)。同時(shí)，模型組小鼠MDA含量有較為顯著的增高，而兩種劑量ASP均使其有不同程度的下調(diào)，以大劑量的下調(diào)幅度更為明顯。這些結(jié)果表明，ASP對(duì)DEX導(dǎo)致的抗氧化能力的減弱有較為確切的拮抗作用，且并未呈現(xiàn)出一定的劑量關(guān)系。

3.3 ASP對(duì)小鼠血糖、血清胰島素及肝糖原活性的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)于DEX引起的血糖水平顯著降低，應(yīng)用ASP進(jìn)行干預(yù)后則出現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，尤其是大劑量組增幅達(dá)17.2%(P＜0.05)。與之相對(duì)應(yīng)的是ASP導(dǎo)致上升的胰島素水平呈下降趨勢(shì)，但同樣只是大劑量組才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。雖然ASP兩劑量組對(duì)DEX引起的糖原含量的降低有輕度恢復(fù)的現(xiàn)象，但影響并不明顯。

表2 ASP對(duì)肝S9組分SOD、GSH及MDA活性的影響(n=8，±s)Tab.2 Effects of ASP on activities of SOD，GSH and MDA in mice intoxicated with dexamethasone(n=8，±s)

表2 ASP對(duì)肝S9組分SOD、GSH及MDA活性的影響(n=8，±s)Tab.2 Effects of ASP on activities of SOD，GSH and MDA in mice intoxicated with dexamethasone(n=8，±s)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.05，3 P＜0.01Compared with control group:1 P＜0.01;Compared with modle group:2 P＜0.05，3 P＜0.01

組 別 劑量/(mg/kg) SOD/(u/mg) GSH/(μmol/g) MDA/(nmol/mg)空白對(duì)照組 －5.44±0.34 9.69±0.93 0.65±0.05 DEX模型組 － 4.22±0.141 7.81±0.581 0.81±0.091小劑量 ASP 組 100 4.97±0.232 8.66±0.882 0.72±0.032大劑量 ASP 組 200 5.07±0.542 8.97±1.022 0.69±0.043

表3 ASP對(duì)小鼠血糖、血清胰島素及肝糖原活性的影響(n=8，±s)Tab.3 Effects of ASP on ADH activity and levels of blood sugar，hepatin in mice intoxicated with dexamethasone(n=8，±s)

表3 ASP對(duì)小鼠血糖、血清胰島素及肝糖原活性的影響(n=8，±s)Tab.3 Effects of ASP on ADH activity and levels of blood sugar，hepatin in mice intoxicated with dexamethasone(n=8，±s)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.05Compared with control group:1 P＜0.01;Compared with modle group:2 P＜0.05

?

3.4 ASP對(duì)小鼠CYP2E1活性的影響

結(jié)果見(jiàn)表4。模型組經(jīng)DEX處理后，CYP2E1未出現(xiàn)明顯改變;預(yù)先給予兩種劑量ASP，對(duì)該指標(biāo)亦未見(jiàn)明顯影響。

表4 ASP對(duì)小鼠CYP2E1活性的影響(n=8，±s)Tab.4 Effects of ASPon hepatic CYP2E1 activities in mice intoxicated with dexamethasone( n= 8，±s)

表4 ASP對(duì)小鼠CYP2E1活性的影響(n=8，±s)Tab.4 Effects of ASPon hepatic CYP2E1 activities in mice intoxicated with dexamethasone( n= 8，±s)

SP/kg)CYP2E1/(nmol/mg·60 min)－105.12±10.29－ 108.20±11.52小劑量 ASP 組 100 115.16±13.05大劑量ASP組200 107.32±12.68

4 討論

在以往的研究中我們?cè)l(fā)現(xiàn)，ASP能有效干預(yù)酒精所致的肝損［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則進(jìn)一步顯示，ASP對(duì)糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物DEX引起的肝臟毒性同樣具有一定的拮抗作用，給予ASP預(yù)處理能明顯降低小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶sALT、sAST的漏出，說(shuō)明其能穩(wěn)定生物膜，降低膜的通透性，從而保護(hù)肝細(xì)胞，且大劑量組的作用似乎更為顯著。該結(jié)果提示，ASP可能在糖皮質(zhì)激素所致的藥物性肝損傷方面有較好的開(kāi)發(fā)潛力，具有進(jìn)一步研究的意義。

在探討其可能的保護(hù)機(jī)制時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，ASP能使肝臟內(nèi)SOD、GSH水平增加，而MDA含量降低，提示ASP對(duì)DEX所致的肝脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)具有較為確切的抑制作用，這可能是其發(fā)揮療效的重要原因之一。我們前期的研究還顯示，短期、超大劑量攝入DEX后血糖水平會(huì)有一個(gè)暫時(shí)的顯著下降，同時(shí)胰島素升高、糖原減少，且相關(guān)性分析表明，低血糖和高胰島素與肝臟損害之間存在著高度相關(guān)性，提示低血糖及高胰島素均可能介導(dǎo)了DEX的肝毒作用。而大劑量ASP對(duì)于這種糖代謝改變均有不同程度的恢復(fù)，說(shuō)明ASP對(duì)血糖的調(diào)節(jié)可能也是其對(duì)抗肝毒性的原因之一。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，介導(dǎo)多種藥物肝毒性的CYP2E1似未直接參與DEX的肝毒效應(yīng)，而ASP對(duì)CYP2E1活性亦無(wú)明顯影響，說(shuō)明其對(duì)肝臟的保護(hù)作用可能與CYP2E1的介導(dǎo)并無(wú)密切關(guān)系。

綜上所述，ASP對(duì)DEX性肝損傷有較為顯著的干預(yù)作用，其機(jī)制與部分恢復(fù)肝臟抗氧化功能、一定程度上改善糖代謝紊亂有關(guān)。

［1］華自森，王建偉，宋姝丹，等.當(dāng)歸多糖對(duì)K562白血病細(xì)胞JAK2、STAT3 表達(dá)和活化的影響［J］.解剖學(xué)雜志，2009，32(1):8-11.

［2］孫文平，羅 紅，楊 光，等.當(dāng)歸多糖激發(fā)免疫反應(yīng)的特征研究［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(2):262-264.

［3］楊鐵虹，賈 敏，梅其炳，等.當(dāng)歸多糖組分AP-3對(duì)不同淋巴細(xì)胞亞群的作用［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2005，26(6):344-346.

［4］Ye Y N，So H L.Effect of polysaccharides from Angelica sinensis on gastric ulcer healing［J］.Life Sci，2003，72(8):925-932.

［5］劉 娟，彭仁琇.純化當(dāng)歸多糖有效干預(yù)急性酒精性肝毒作用及其機(jī)制［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)研究與臨床，2006，4(10):7-9.

［6］劉 娟，彭仁琇，樂(lè) 江，等.當(dāng)歸多糖的分離純化及其部分理化性質(zhì)的研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2004，19(6):412-414.