鄭全輝 陸 斌 葛淑芝 張愛紅 (河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

鋅指蛋白(ZNF)185是一種c端含有LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白，由于mRNA的選擇性剪切和轉(zhuǎn)錄/翻譯起始位點(diǎn)的差異，ZNF185編碼多個(gè)不同的蛋白剪切體。ZNF185在人體多種組織表達(dá)，尤以骨髓和前列腺表達(dá)最高〔1〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ZNF185基因參與肌動(dòng)蛋白(actin)共定位，并在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)〔2，3〕。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞中，ZNF185的表達(dá)顯著降低，然而，對(duì)于ZNF185不同蛋白剪切體在前列腺癌細(xì)胞增殖中的作用少見報(bào)道。本文擬觀察ZNF185不同蛋白剪切體與actin結(jié)合，并檢測(cè)ZNF185不同蛋白剪切體對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常前列腺組織取自唐山工人醫(yī)院，人前列腺癌細(xì)胞系DU145、LNCaP、PWPE2由本實(shí)驗(yàn)室凍存。TRIzol試劑盒、Lipofactamine2000購(gòu)自Invitrogen公司;各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自 Axygen公司;兔抗人ZNF185一抗、兔抗人actin一抗和pEGFPC2綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒由中科院動(dòng)物所趙勇研究員提供;HRP羊抗兔二抗和Phalloidin-TRITC(羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽)購(gòu)自北京博奧森公司;蛋白提取試劑盒和Bio-Rad蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司，引物由上海生物工程服務(wù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡 提取組織或細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。各取10 μg進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳。電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)(4℃，恒流300 mA，2 h)到硝酸纖維素膜(NC)上，然后將NC膜在含100 g/L脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，加兔抗人ZNF185一抗(1∶1 000)4℃過(guò)夜，TBST洗去未結(jié)合的一抗，再加HRP羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫作用1 h，TBST沖洗后加底物反應(yīng)3 min，暗室曝光。

1.2.2 ZNF185 CDNA克隆 正常前列腺組織總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PCR采用Pfx高保真DNA聚合酶和下列引物：上游：5'-GGAATTCATGAGTATCTCAGCTCTTG-3'，下 游：5'-ACGCGTCGACTAGAAGAGCTTCTCATAGC-3'。上、下游引物分別加入EcoR I/Sal I酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件：94℃2 min，然后 94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸 1 min;30 個(gè)循環(huán)，最后72℃孵育10 min，PCR產(chǎn)物膠回收并純化。EcoR I/Sal I雙酶切PCR產(chǎn)物和pEGFPC2質(zhì)粒，回收純化酶切產(chǎn)物，并利用T4 DNA連接酶將其連接在一起。轉(zhuǎn)化，挑克隆進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人前列腺癌細(xì)胞系DU145采用RPMI-1640培養(yǎng)基，5%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用Lipofactamine2000，按操作說(shuō)明進(jìn)行。為獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF185不同蛋白剪切體的細(xì)胞，DU145在轉(zhuǎn)染24 h后，1∶2分離培養(yǎng)過(guò)夜，加入G418(600 mg/ml)篩選抗性克隆。選擇培養(yǎng)2個(gè)月后，采用流式細(xì)胞儀分選綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 免疫熒光染色 在涂布纖維黏連蛋白(10 mg/ml)的玻片上培養(yǎng)ZNF185不同蛋白剪切體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛中固定20 min，然后用0.1%Triton X-100/PBS透膜5 min。采用Phalloidin-TRITC(1∶40)標(biāo)記actin纖維。LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察ZNF185蛋白剪切體與actin纖維的共定位。

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 分別取 ZNF185(689aa)、ZNF185(452aa)和pEGFP2載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種96孔板(2×104/孔)，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔。每隔24 h收取細(xì)胞，臺(tái)盤藍(lán)染色計(jì)數(shù)，計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。連續(xù)計(jì)數(shù)6 d，繪制增殖曲線。

2 結(jié)果

2.1 ZNF185在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低 Western印跡檢測(cè)人正常前列腺組織和不同前列腺癌細(xì)胞 LNCaP，DU145，PWPE2中ZNF185的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZNF185在正常前列腺組織高表達(dá)，而在檢測(cè)的前列腺癌細(xì)胞中，ZNF185的表達(dá)顯著降低。見圖1。

2.2 ZNF185蛋白剪切體克隆 從正常前列腺組織提取RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pEGFPC2載體，測(cè)序分析表明，克隆 cDNA主要編碼兩種多肽：一種為689aa多肽，包含ZNF185全長(zhǎng)編碼序列，其羧基端含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(zinc-finger motif)組成的LIM結(jié)構(gòu)域，氨基端為actin骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ATD);另一種為452aa的多肽，除不含氨基端ATD結(jié)構(gòu)域外，其他序列與全長(zhǎng)ZNF185編碼序列相同。見圖2。

2.3 全長(zhǎng)ZNF185結(jié)合actin纖維 分別將編碼689aa和452aa的ZNF185-pEGFPC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系DU145，采用激光共聚焦顯微鏡觀察不同ZNF185蛋白剪切體的細(xì)胞定位和與actin纖維的結(jié)合。ZNF185-EGFPC2編碼蛋白由于帶有綠色熒光蛋白(GFP)顯綠色，actin熒光抗體受激發(fā)顯紅色。從圖3可以看出，全長(zhǎng)ZNF185蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)，并與actin纖維染色完全重合，而編碼452aa的ZNF185蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有分布，但由于缺乏ATD結(jié)構(gòu)域不與actin纖維結(jié)合。

圖1 Western印跡檢測(cè)ZNF185的表達(dá)

圖2 ZNF185蛋白剪切體克隆

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)452aa和689aa ZNF185與細(xì)胞actin骨架共定位

2.4 全長(zhǎng)ZNF185抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖 與正常前列腺組織相比，ZNF185在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，提示ZNF185可能調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖。為此，本文分別將689aa和452aa的ZNF185-pEGFPC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DU145，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，Western印跡檢測(cè)所得DU145細(xì)胞分別高表達(dá)全長(zhǎng)ZNF185(689aa)和N端缺失ATD結(jié)構(gòu)域的ZNF185(452aa)(圖 4A)。分別將空載體，689aa和 452aa ZNF185-pEGFPC2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞接種96孔板，結(jié)果顯示，表達(dá)ZNF185全長(zhǎng)序列689aa的DU145與轉(zhuǎn)染空載體pEGFPC2的對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖速率顯著減低;而轉(zhuǎn)染編碼452aa ZNF185質(zhì)粒的DU145細(xì)胞，增殖速率與對(duì)照組相比沒(méi)有差異(圖4B)。

圖4 全長(zhǎng)ZNF185抑制DU145細(xì)胞增殖

3 討論

LIM蛋白是一類進(jìn)化保守的蛋白家族，因其序列中包含LIM(Lin-1，Isl-1，Mec-3)結(jié)構(gòu)域而得名。ZNF185蛋白屬于第三組LIM結(jié)構(gòu)域蛋白，首先由Heiss等通過(guò)定位克隆的方法得到，其基因定位于X染色體長(zhǎng)臂2區(qū)8帶(Xq28)DXS52區(qū)域?；诒磉_(dá)序列標(biāo)簽(EST)和基因組序列分析，ZNF185 cDNA編碼一個(gè)452aa的蛋白，在其 C端有一個(gè) LIM結(jié)構(gòu)域，并推測(cè)ZNF185可能與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)〔1〕。

2006年，Zhang等〔4〕從正常人前列腺癌組織中通過(guò)克隆測(cè)序，得到ZNF185全長(zhǎng)cDNA。ZNF185全長(zhǎng)cDNA編碼蛋白比Heiss等克隆到的ZNF185分子在N端長(zhǎng)出135個(gè)氨基酸，而且這段長(zhǎng)出來(lái)的序列可以與actin相結(jié)合，被定義為ATD結(jié)構(gòu)域。同時(shí)該研究也發(fā)現(xiàn)ZNF185編碼基因包含24個(gè)外顯子，由于不同外顯子剪切，ZNF185基因至少編碼4個(gè)不同氨基酸序列的蛋白產(chǎn)物，分別為：721aa、689aa、660aa 和 452aa，Heiss等公布的序列只是其中之一。721aa、689aa、660aa ZNF185包含多個(gè)蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，如：PDZ(Postsynaptic density-95，Discs large，zonaoccludens-1)、LD(Leucine-aspartate repeat)和 ATD 結(jié)構(gòu)域;而452aa ZNF185缺少ATD結(jié)構(gòu)域，提示可能與其他ZNF185蛋白剪切體存在功能差異。

ZNF185在人多種組織表達(dá)，前列腺組織表達(dá)最高，骨髓、外周血、甲狀腺、腦、腎等組織也有較高表達(dá)，而在前列腺癌細(xì)胞中，ZNF185表達(dá)顯著降低，這與Vanaja等〔5〕的結(jié)果一致。然而，ZNF185表達(dá)多個(gè)不同的蛋白剪切體，它們?cè)谇傲邢偌?xì)胞中的功能差異目前尚無(wú)報(bào)道。因此，我們克隆了689aa和452aa的ZNF185編碼序列。熒光共定位研究顯示只有689aa ZNF185與細(xì)胞actin骨架結(jié)合，與這兩個(gè)ZNF185蛋白剪切體的結(jié)構(gòu)域差異相符。有意思的是，452aa ZNF185不能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，而只有包含ATD結(jié)構(gòu)域的689aa ZNF185能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。此結(jié)果表明，ZNF18與細(xì)胞actin骨架的結(jié)合是其發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵。目前，細(xì)胞蛋白骨架成分表達(dá)和功能改變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系是腫瘤研究的一個(gè)亮點(diǎn)〔6〕，本研究結(jié)果為此領(lǐng)域的研究提供了新的線索。值得注意的是，452aa ZNF185在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)也顯著降低。因此，此蛋白剪切體在正常前列腺細(xì)胞中的功能尚需進(jìn)一步探討。

1 Heiss NS，Gloeckner G，Bachner D，et al.Genomic structure of a novel LIM domain gene(ZNF185)in Xq28 and comparisons with the orthologous murine transcript〔J〕.Genomics，1997;43(3)：329-38.

2 Rabbitts TH，Boehm T.LIM domains〔J〕.Nature，1990;346(6283)：418.

3 Sanchez-Garcia I，Rabbitts T.The LIM domains：a new structural motif found in zinc-finger-like protein〔J〕.Trends Genet，1994;10(9)：315-20.

4 Zhang JS，Gong A，Young CY.ZNF185，an actin-cytoskeleton-associated growth inhibitory LIM protein in prostate cancer〔J〕.Oncogene，2007;26(1)：111-22.

5 Vanaja DK，Cheville JC，Iturria SJ，et al.Transcriptional silencing of zinc finger protein 185 identified by expression profiling is associated with prostate cancer progression〔J〕.Cancer Res，2003;63(14)：3877-82.

6 Yamaguchi H，Condeelis J.Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007;1773(5)：642-52.