葛宇松 尹 琳 (大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116023)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白(Aβ)在腦組織及血管周圍異常沉積形成老年斑，是AD的一個(gè)重要的病理學(xué)特征。Aβ可以引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和死亡，Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制是復(fù)雜的，但是其通過氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)一步加重神經(jīng)毒性作用并且增加細(xì)胞的易損性，從而增加了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此通過減少Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)為疾病的治療提供一個(gè)有效的途徑。親環(huán)素A(CyPA)是親環(huán)素家族成員之一，在腦組織中廣泛表達(dá)。已有研究證實(shí)CyPA在氧化應(yīng)激后表達(dá)升高，并且可以保護(hù)細(xì)胞免遭氧化應(yīng)激損傷〔1〕，因此本試驗(yàn)利用 Aβ25～35誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞凋亡，觀察CyPA對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)中心，Aβ25～35、MTT、PI和 Rd 123 購自 Sigma公司，CyPA 購自 Biomol公司，PRMI1640購自Gibco公司，胎牛血清，馬血清，胰蛋白酶購自Hyclone公司，DCF-DA購自碧云天生物技術(shù)研究所，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 PC12細(xì)胞在PRMI1640培養(yǎng)質(zhì)中培養(yǎng)，其中含10%滅活馬血清、5%胎牛血清，100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。使用的Aβ25～35溶于去離子水中，臨用前于37℃下孵育2 d使其凝聚。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 MTT檢測細(xì)胞存活率 將PC12細(xì)胞以1×105/ml接種于 96 孔板，每孔 100 μl，各組用不同終濃度的 CyPA(0，0.1，1，10，100 nmol/L)處理30 min，再加入 0 或 10 μmol/L 的 Aβ25-35，48 h后每孔加入 MTT(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 100 μl，搖床震搖，待結(jié)晶紫完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的570 nm吸光值，以對照組細(xì)胞生存率為100%，其余各組按細(xì)胞生存率=(各組吸光度－空白組吸光度)/(對照組吸光度－空白組吸光度)×100%。

1.4 HE染色 將PC12細(xì)胞進(jìn)行爬片，各組分別用0或10 nmol/L CyPA處理 30 min，再加入 0或 10 μmol/L的Aβ25～35，48 h后棄掉培養(yǎng)液，PBS洗3 次，甲醇固定，進(jìn)行 HE 染色，光鏡下觀察并拍照。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測凋亡 將PC12細(xì)胞以5×105/ml接種于6孔板，每孔2 ml，各組分別用0或10 nmol/L CyPA處理30 min，再加入 0 或 10 μmol/L Aβ25～35，48 h 后收集細(xì)胞，PBS洗2次，1 000 r/min離心 10 min，70%乙醇固定過夜，1 000 r/min離心10 min，用 PBS洗 2 次，加入50 μl RNAase至終濃度為1 g/L，37℃水浴 30 min，每管加 PI至終濃度為50 mg/L，4℃避光孵育30 min，過濾后上機(jī)檢測，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。按流式細(xì)胞儀配置的軟件計(jì)算凋亡率。

1.6 線粒體膜電位的測定 將PC12細(xì)胞以5×105/ml接種于6孔板，每孔2 ml，各組分別用0或10 nmol/L CyPA處理30 min，再加入 0 或 10 μmol/L 的 Aβ25～35，24 h 后收集細(xì)胞，PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min，每管加Rh123至終濃度10 mg/L，37℃避光孵育30 min，過濾后上機(jī)檢測，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。測定的數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測定熒光強(qiáng)度降低的細(xì)胞百分率。

1.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧的測定 將PC12細(xì)胞以5×104/ml接種于6孔板，每孔2 ml，各組分別用0或10 nmol/L CyPA處理30 min，再加入0 或10 μmol/L 的 Aβ25～35，24 h 后吸出培養(yǎng)液，每孔加入 DCFH-DA(10 μmol/L)1.5 ml，37℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，用無血清培養(yǎng)液洗3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。將PC12細(xì)胞以5×105/ml接種于6孔板，每孔2 ml，藥物處理同前，24 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min棄上清，加入 DCFH-DA(10 μmol/L)1 ml，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，用PBS洗3次，流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以s表示。組間多樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，兩均數(shù)比較用SNK-q檢驗(yàn)，兩組比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT觀察PC12細(xì)胞的存活率 用不同終濃度(0、1、1、10、100 nmol/L)的CyPA預(yù)處理PC12細(xì)胞30 min，其存活率分別為：(100.72±7.91)%、(101.97±6.77)%、(105.21±6.88)%、(109.79±10.86)%，再加入 0或 10 μmol/L的Aβ25～35繼續(xù)培養(yǎng)48 h，可見CyPA處理后能提高細(xì)胞的存活率，呈濃度依賴性，但是與正常對照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Aβ25～35誘導(dǎo)組的細(xì)胞存活率較正常對照組明顯下降〔(47.73±8.93)%vs(100.00±0.00)%〕，而藥物保護(hù)組的細(xì)胞存活率隨CyPA劑量的增大而升高，0.1 nmol/L的CyPA可以輕度提高細(xì)胞的存活率，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(52.02±6.85)%，P＞0.05〕，1、10和100 nmol/L的 CyPA對細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用〔(67.21±12.98)%、(75.78±11.59)% 和(90.08±9.12)%，P ＜0.05〕。

2.2 HE染色觀察PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 正常PC12細(xì)胞和CyPA處理組的細(xì)胞胞體飽滿，細(xì)胞間聯(lián)系緊密，胞核藍(lán)紫色，Aβ25～35處理組的細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)皺縮或飽漲，胞質(zhì)濃縮，核固縮或碎裂，呈藍(lán)黑色，10 nmol/L CyPA+Aβ25～35組的大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)接近正常。見圖1。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞的凋亡率變化 PI單染后流式細(xì)胞儀檢測可見，正常對照組細(xì)胞凋亡率為(4.56±0.61)%，10 nmol/LCypA處理組(4.77±0.73)%，兩者相近，Aβ25～35處理組細(xì)胞凋亡率可達(dá)(23.57±3.82)%，較正常對照組明顯提高(P ＜0.05)，而 10 nmol/LCypA+Aβ25～35組細(xì)胞凋亡率為(12.83±1.97)%，較 Aβ25～35處理組明顯降低(P＜0.05)。

2.4 Rh123檢測線粒體跨膜電位的改變 正常對照組和10 nmol/L CyPA處理組去極化細(xì)胞的百分率分別為(7.54±0.91)%和(6.35±1.05)%，而用 Aβ25～35處理 PC12細(xì)胞24 h后，去極化細(xì)胞所占的百分率明顯增高，達(dá)到(18.92±2.11)%，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10 nmol/L CyPA+Aβ25～35組去極化細(xì)胞所占的百分率為(11.82±1.78)%，較Aβ25～35處理明顯降低(P ＜0.05)。

2.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的變化 倒置熒光顯微鏡觀察正常對照組和10 nmol/L CyPA處理組的PC12細(xì)胞幾乎未見綠色熒光，PC12細(xì)胞經(jīng)Aβ25～35處理24 h后可見細(xì)胞發(fā)出較亮的綠色熒光，應(yīng)用10 nmol/L CyPA處理后，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯減弱。見圖2。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DCFH-DA的定量檢測顯示，正常對照組和10 nmol/L CyPA處理組PC12細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度分別為358.18±27.54和366.43±32.20，二者之間比較無顯著性差別，而用10 μmol/L的Aβ25～35處理 PC12細(xì)胞24 h后，平均熒光強(qiáng)度明顯增高，達(dá)到691.68±43.97，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10 nmol/L CyPA+Aβ25～35組平均熒光強(qiáng)度為518.58±41.60，較 Aβ25～35處理明顯降低(P ＜0.05)。

圖1 HE染色觀察PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(×400)

圖2 DCFH-DA染色觀察PC12細(xì)胞ROS水平的改變(×400)

3 討論

β-淀粉樣蛋白在腦組織及血管周圍異常沉積可以引起氧化應(yīng)激損傷，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷對于AD的發(fā)生發(fā)展具有較為重要的意義〔2〕。實(shí)驗(yàn)顯示通過抗氧化劑干預(yù)后可保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元以及PC12細(xì)胞免受Aβ的損傷〔3〕?？梢姡趸瘧?yīng)激反應(yīng)與Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等毒性作用之間關(guān)系密切。

CyPA是一種高度保守的蛋白質(zhì)，從低等原核生物到哺乳動(dòng)物都有這種蛋白。在人體中不同器官中CyPA的含量也不相同，其中腦組織中的含量最高，顯示了它可能對神經(jīng)元有重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，rhCyPA在體外培養(yǎng)神經(jīng)元遭受缺血和異丙基苯損傷的過程中起到保護(hù)作用〔1〕。Redell等〔4〕研究顯示，大鼠海馬組織受戳刺傷后，于海馬部位注射rhCyPA，明顯減少海馬神經(jīng)元的損傷，降低血腦屏障的通透性。我們的研究也顯示rhCyPA通過上調(diào) Bcl-2表達(dá)和下調(diào) Bax表達(dá)對抗 Aβ25～35對PC12細(xì)胞的毒性作用，減少細(xì)胞凋亡〔5〕，但CypA的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制還很復(fù)雜，本試驗(yàn)在氧化應(yīng)激方面進(jìn)一步研究CypA在抑制Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞毒性方面的作用。

本試驗(yàn)顯示用Aβ25～35處理PC12細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率明顯下降，細(xì)胞的凋亡率明顯增加，該結(jié)果與以往的試驗(yàn)研究結(jié)果一致〔3〕，應(yīng)用 rhCyPA 干預(yù)后，明顯對抗了 Aβ25～35的毒性作用，使得細(xì)胞的存活率增加，細(xì)胞的凋亡率降低，說明rhCyPA對PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。

線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子及其他離子的不對稱分布形成線粒體跨膜電位，線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中一個(gè)早期普遍事件〔6〕。造成線粒體跨膜電位下降的主要原因是線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPT)的開放，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜通透性增加，通過釋放凋亡啟動(dòng)因子細(xì)胞色素C(Cyt-c)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，Aβ25～35處理組PC12細(xì)胞線粒體跨膜電位較正常對照組明顯降低，而應(yīng)用rhCyPA干預(yù)后，可以提高線粒體的跨膜電位，細(xì)胞凋亡減少。

ROS是細(xì)胞有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一些小分子物質(zhì)，主要包括、OH·及其活性衍生物如H2O2、HOCl、O2等。這些物質(zhì)具有較高的反應(yīng)活性，易與細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的廣泛損傷，如膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)及核酸等的氧化損傷等。近年的研究認(rèn)為，活性氧是細(xì)胞凋亡的信號(hào)之一，ROS的產(chǎn)生可直接或間接改變線粒體跨膜電位，啟動(dòng)線粒體的信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。另外線粒體又是細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要來源之一，當(dāng)線粒體跨膜電位下降，又造成ROS的增加，并且釋放到胞漿中，通過激活凋亡信號(hào)通路從而進(jìn)一步導(dǎo)致凋亡的發(fā)生〔8〕。因此在凋亡過程中，ROS既是促發(fā)和加速線粒體跨膜電位改變的重要效應(yīng)分子，又是線粒體跨膜電位改變的產(chǎn)物。這種正反饋機(jī)制使線粒體跨膜電位的下降進(jìn)入不可逆過程，細(xì)胞凋亡發(fā)生。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Aβ25～35處理組PC12細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度較對照組明顯增加與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同〔9〕，而CyPA預(yù)處理后平均熒光強(qiáng)度值較Aβ25～35組明顯下降，可見CyPA能夠有效抑制Aβ25-35引起的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而保護(hù)PC12細(xì)胞抵抗Aβ25～35誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示Aβ25～35不僅引起線粒體跨膜電位的降低，而且使ROS生成增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡以及死亡。CypA可以保護(hù)PC12細(xì)胞抵抗Aβ25～35所引起的細(xì)胞存活率的降低和凋亡率的增加，主要是通過抑制Aβ25～35所引起的氧化應(yīng)激損傷，提高線粒體的跨膜電位而起作用。然而CypA起保護(hù)作用的機(jī)制還很復(fù)雜，還有待進(jìn)一步的研究和發(fā)現(xiàn)，為CypA應(yīng)用于老年癡呆提供有效的理論依據(jù)。

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