周衛(wèi)華 譚莉明 米長(zhǎng)忠 鐘 飛 (吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

絞股藍(lán)皂甙對(duì)阿爾茨海默病小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)功能的影響

周衛(wèi)華 譚莉明 米長(zhǎng)忠 鐘 飛 (吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

目的 探討絞股藍(lán)皂甙對(duì)D-半乳糖(D-gal)所致阿爾茨海默病(AD)模型小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)功能的影響。方法 昆明小鼠頸背部皮下注射10%D-gal，連續(xù)6 w造模。同時(shí)，各組分別灌胃生理鹽水(正常對(duì)照組、模型組)、絞股藍(lán)(高、低劑量組)。給藥結(jié)束后進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，24 h后進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)試和海馬膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)與乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測(cè)定以及Western印跡檢測(cè)ChAT表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，D-gal模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，模型組ChAT活性和ChaT表達(dá)明顯下降(P＜0.05，P＜0.01);模型組AchE活性明顯升高(P＜0.01)。給予絞股藍(lán)皂甙可明顯改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能(P＜0.05，P＜0.01)，增強(qiáng)海馬ChAT活性(P＜0.01)和降低AchE活性(P＜0.01)，上調(diào)ChAT的表達(dá)(P＜0.01)。結(jié)論 絞股藍(lán)皂甙可明顯提高模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善海馬膽堿能系統(tǒng)功能。

絞股藍(lán)皂甙;半乳糖;阿爾茨海默病;膽堿能系統(tǒng)

絞股藍(lán)為我國(guó)的名貴中草藥，在湘西地區(qū)廣泛種植和飲用，已有研究表明絞股藍(lán)對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯的改善作用〔1，2〕。絞股藍(lán)皂甙(GP)是從中分離出來與人參皂甙有類似骨架的達(dá)瑪烷型絞股藍(lán)皂甙，具有多種生理活性;其中抗癌、抗衰老、抗?jié)?、?zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、降血脂等作用〔3〕，已得到藥理和臨床研究的證實(shí)。研究表明，中樞膽堿能系統(tǒng)是學(xué)習(xí)記憶的重要機(jī)制。乙酰膽堿(ACh)是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要遞質(zhì)，參與學(xué)習(xí)和記憶等相關(guān)生理活動(dòng)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AChE)是ACh代謝的2個(gè)關(guān)鍵酶，本研究旨在觀察GP對(duì)小鼠中樞膽堿能系統(tǒng)的影響，探討GP影響學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

昆明種雄性小白鼠，6～8周齡、體重18～

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物試劑及儀器

絞股藍(lán)皂甙購(gòu)于陜西浩洋生物科技有限公司，D-半乳糖D-gal，(購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司)，AchE試劑盒、ChAT試劑盒及BCA蛋白測(cè)試盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。低溫高速離心機(jī)(TGL-16G)，UV-3100紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BINTA2020D，深圳宇德立生物科技有限公司)，半干式轉(zhuǎn)膜儀(DYCP-40C，北京六一廠)，羊源抗鼠ChAT抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG，β-actin小鼠多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗小鼠IG，均購(gòu)于Santa公司，ECL試劑盒(Pierce公司)。

1.3 動(dòng)物模型制備〔4〕

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。模型組、治療組，每日頸背部皮下注射10%D-gal 125 ml·kg－1·d－1，持續(xù) 6 w，空白組注射同劑量的生理鹽水。從第1天開始，絞股藍(lán)高劑量組和低劑量組〔5〕，分別灌胃給予180和60 mg·kg－1·d－1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，模型組和空白組也灌胃等量的生理鹽水。

1.4 小鼠學(xué)習(xí)能力測(cè)定〔4〕

采用改良的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，即將小鼠從槽壁四個(gè)起始點(diǎn)分別放入水槽中，記錄從放入小鼠到小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，小鼠找到平臺(tái)后，讓小鼠在平臺(tái)上休息30 s，如小鼠120 s仍找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將小鼠放置于平臺(tái)上，逃避潛伏期記為120 s，也讓小鼠在平臺(tái)上休息30 s。造模成功后，進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，記錄每只小鼠潛伏期的平均值。

1.5 海馬ChAT和AChE活性檢測(cè)

小鼠水迷宮測(cè)試結(jié)束后迅速斷頭取腦，分離兩側(cè)海馬組織，按1∶10質(zhì)量比加入生理鹽水，勻漿30 s，勻漿液在4℃以4 000 r/min離心10 min，吸取上清－20℃冰凍備用，按試劑盒說明書測(cè)定AChE活性，同時(shí)采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定海馬組織蛋白含量。

1.6 海馬組織勻漿液制備及Western印跡

分離海馬組織，勻漿液用BCA法進(jìn)行總蛋白定量，從各組樣品中分別取60 μg的總蛋白上樣，用8%SDS-PAGE，4℃，20 mA電泳，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)電泳到分離膠時(shí)調(diào)節(jié)電流為30 mA，繼續(xù)電泳2.5 h。通過半干式電轉(zhuǎn)法將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上，轉(zhuǎn)膜1 h。NC膜用10%脫脂牛奶常溫下封閉2 h，羊源抗鼠ChAT抗體(1∶1 000)孵育4 h，再與HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗(1∶2 000)孵育1 h。按ECL試劑盒說明書進(jìn)行顯色反應(yīng)。暗室中曝光，顯影，定影。用凝膠成像系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)皂甙對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

小鼠用D-gal皮下注射連續(xù)6 w后模型組，逃避潛伏期延長(zhǎng)〔(38.5±7.66)s〕，與正常組相比有顯著性差異〔(24.1±7.30)s，P＜0.01〕，灌胃給予絞股藍(lán)皂甙高、低劑量組后，逃避潛伏期縮短，與模型組相比有顯著性差異〔(27.8±6.44)、(30.8±6.61)s，P ＜0.01，P ＜0.05〕。

2.2 絞股藍(lán)皂甙對(duì)小鼠海馬組織生化指標(biāo)的影響

模型組小鼠海馬組織ChAE活性升高，ChAT活性降低，與正常組有顯著性差異(P＜0.01)，絞股藍(lán)皂甙灌胃給藥后小鼠海馬組織中ChAE活性降低，ChAT活性升高，與模型組有顯著性差異(P＜0.05，P ＜0.01)。見表1。

表1 絞股藍(lán)皂甙對(duì)各組小鼠海馬組織ChAE活性、ChAT含量的影響(±s，n=10，U/mg)

表1 絞股藍(lán)皂甙對(duì)各組小鼠海馬組織ChAE活性、ChAT含量的影響(±s，n=10，U/mg)

ChAE ChAT正常組 1.16±0.471) 86.5±10.381)組別模型組 1.97±0.58 69.9±8.78絞股藍(lán)低劑量組 1.32±0.421) 79.4±10.72)絞股藍(lán)高劑量組 1.24±0.411) 84.7±9.981)

與模型組比較：1)P＜0.01;2)P＜0.05

2.3 絞股藍(lán)皂甙對(duì)海馬組織ChAT蛋白的表達(dá)的影響

模型組小鼠海馬組織ChAT的表達(dá)降低(0.348±0.034)，與正常組有顯著性差異〔(0.645±0.013)，P＜0.01〕，高、低劑量絞股藍(lán)皂甙灌胃給藥后小鼠海馬組織中ChAT的表達(dá)明顯升高，與模型組有顯著性差異〔(0.526±0.064)、(0.487±0.039)，P＜0.01〕。

3 討論

注射大劑量D-gal會(huì)引起氧自由基在體內(nèi)過量堆積，產(chǎn)生一系列與老化和AD相似的病理、生理改變，可作為部分模擬AD的動(dòng)物模型〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，注射D-gal可致大鼠、小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙〔7，8〕。在本研究中，大量注射D-gal使AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，在水迷宮中尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，在研究中，GP對(duì)D-gal所致AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯改善作用。

乙酰膽堿的合成酶ChAT可催化乙酰輔酶A和膽堿生成乙酰膽堿，其分布與Ach的分布幾乎平行，故常作為估計(jì)Ach含量的間接指標(biāo)〔9〕。而AchE的活性能間接反映乙酰膽堿在腦中分解率的變化;兩者共同調(diào)節(jié)腦內(nèi)ACh的含量，其活性變化可間接反映腦內(nèi)ACh的代謝情況〔10〕。AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)功能明顯下降，其臨床癥狀的嚴(yán)重程度和膽堿能系統(tǒng)的活性密切相關(guān)，研究表明老年癡呆病人腦組織中AchE活性顯著升高〔11〕，使Ach分解增加，造成Ach減少，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力下降。本研究提示GP可以提高衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與GP提高ChAT活性、升高ChAT蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)腦內(nèi)ACh合成有關(guān)，GP改善海馬膽堿能系統(tǒng)功能是其改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的基礎(chǔ)。

1 張曉喻，黎 艷，雍 彬，等.復(fù)方絞股藍(lán)皂甙改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的研究〔J〕.食品科學(xué)，2007;28(3)：330-3.

2 鄧家剛，杜正彩，郝二偉.復(fù)方絞股藍(lán)對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)單胺氧化酶活性的影響〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007;2(12)：692-4.

3 楊 輝.絞股藍(lán)皂試藥理研究進(jìn)展〔J〕.淮南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2001;3(2)：42-3.

4 周衛(wèi)華，米長(zhǎng)忠，吳仕筠，等.果王素對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010;21(8)：1915-6.

5 安麗霞，趙 俊.絞股藍(lán)總皂甙對(duì)小鼠抗衰老功能的影響〔J〕.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007;5(9)：31-3.

6 陸盈盈，高良才，袁崇剛.D-半乳糖致老年性癡呆模型的評(píng)價(jià)和海馬腦區(qū)甘丙肽表達(dá)研究〔J〕.中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2007;14(1)：191-3.

7 苗明三，馬 霄，張廣偉，等.五味子醇提物對(duì)小鼠老化模型腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(15)：2162-3.

8 王愛梅，李 弋.葛根異黃酮對(duì)衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬乙酰膽堿酯酶的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(15)：2326-7.

9 Bisaglia M，Venezia V，Piccioli P，et al.Acetaminophen protects hippocampal neurons and PC12 cultures from amyloid beta-peptides induced oxidative stress and reduces ChAT activation〔J〕.Neurochem Int，2002;41(1)：43-54.

10 Lyness SA，Zarow C，Chui HC.Neuron loss in key cholinergic and an imergic nuclei in Alzheimer disease：a meta analysis〔J〕.Neurobiol Aging，2003;24(1)：1-23.

11 Bartolucci C，Siotto M，Ghidini E，et al.Structural determinants of Torpedo californica acetyl cholinesterase inhibition by the novel and orally active carbamate based antialzheimer drug ganstigmine(CHF-2819)〔J〕.J Med Chem，2006;49(17)：5051-8.

Effects of gypenosides on the hippocampal cholinergic system in D-galactose induced Alzheimer's disease in mice

ZHOU Wei-Hua，TAN Li-Ming，MI Chang-Zhong，et al.
Jishou University School of Medicine，Jishou 416000，Hunan，China

Objective To investigate the effects of gypenosides on the hippocampal cholinergic system in D-galactose induced Alzheimer's disease(AD)in mice.Methods The mice were given subcutaneous injection of 10%D-galactose for 6 weeks(125 ml·kg－1·d－1).Normal saline，gypenosides respectively were given by intragastric administration in different study groups.The mice were trained to find the platform in the water maze on the 43th day.After 24 hours，learning and memory ability was tested，choline acetyltransferase(chAT)activity，acetylcholinesterase(AchE)activity，the expression of ChAT in hippocampus was observed by Western blotting after treatment.Results Compared with the normal control group，the learning and memory dysfunction，the decreases of ChAT activity and expression of ChAT were found in model group，AchE activity was increased in model group(P＜0.05，P＜0.01).The gypenosides could markedly attenuate cognitive dysfunction，elevate ChAT and expression of ChAT，decrease AchE activity in the hippocampi of mice treated with D-galactose(P＜0.05，P＜0.01).Conclusions The gypenosides can significantly improve the hippocampal cholinergic system function，and thus enhance the learning and memory ability in D-galactose induced AD model mice model.

Gypenosides;D-galactose;Alzheimer's disease;Cholinergic system

R285.5

A

1005-9202(2012)22-4943-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.041

湖南省科技廳基金項(xiàng)目(2011TJ3202);湘西州科技局課題項(xiàng)目(2009zd06)

周衛(wèi)華(1978-)，男，講師，碩士，主要從事中醫(yī)藥抗衰老研究。

〔2012-01-04收稿 2012-08-07修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)