王建杰 羅文哲 苗 智 宋漢君 齊建祥 王茉琳 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 54007)

丹皮酚誘導(dǎo)人MCF-7細(xì)胞凋亡的機(jī)制

王建杰 羅文哲 苗 智 宋漢君 齊建祥1王茉琳 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 觀察丹皮酚誘導(dǎo)人MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)和凋亡率的機(jī)制。方法 應(yīng)用MTT法觀察丹皮酚對MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用;應(yīng)用hoechst單染觀察丹皮酚對腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響;Annexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀測定丹皮酚誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的凋亡率。結(jié)果

丹皮酚作用于MCF-7細(xì)胞的IC50為60 mg/L;細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)核碎裂、凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡特征;60 mg/L丹皮酚作用24 h、48 h的凋亡率分別為14.24%和28.47%。結(jié)論 丹皮酚通過誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞生長。

丹皮酚;細(xì)胞凋亡;乳腺癌

牡丹皮的有效成分具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌、肝癌、肺癌、喉癌、乳腺癌等有效治療方劑中均包含有牡丹皮〔1〕。丹皮酚 (Paeonol)是牡丹皮中的主要活性成分。據(jù)文獻(xiàn)報道，丹皮酚能抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖，如人白血病細(xì)胞株(K562)，人肝癌細(xì)胞株(Bel-7404)，人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)以及人大腸癌細(xì)胞株(HT-29)，并能夠增強(qiáng)化療藥物順鉑抗食管癌的作用〔2〕。本課題組應(yīng)用丹皮酚處理小鼠乳腺癌(EMT6)模型，證實丹皮酚具有抗乳腺癌的作用〔3〕。但對于人的乳腺癌細(xì)胞尚沒有相關(guān)報道。本研究應(yīng)用人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞觀察丹皮酚作用于乳腺癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人MCF-7細(xì)胞株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)液購于Gibco公司，胎牛血清來源于Hyclone公司。四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)為北京拜爾迪生物技術(shù)公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)為Sigma Aldrich Inc公司產(chǎn)品。Hoechst購于beyotime公司。Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京KeyGen生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀，Epics-XLⅡ型，美國Becton Dickinson公司;熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)，日本Nikon公司;Multiskan MK3型酶標(biāo)儀，美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人MCF-7細(xì)胞以適量濃度接種于9 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每2～3 d傳代1次。試驗均于細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行。

1.3 MTT法檢測丹皮酚對MCF-7細(xì)胞增殖活性的影響

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞密度至5 ×104～1 ×105/ml，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μl，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每個濃度均設(shè)4個平行孔，用RPMI1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照組，同時設(shè)空白調(diào)零，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h、48 h 后，每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入200 μl DMSO溶液，振蕩10 min后酶標(biāo)儀于492 nm處測OD值，按式計算細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 Hoechst 33342熒光單染觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)

調(diào)細(xì)胞密度至5×104個/ml，接種于 6孔板中，每孔 3 ml，24 h后，吸棄培養(yǎng)液。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，60 mg/L丹皮酚處理細(xì)胞，陰性對照組為RPMI1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入100 μl Hoechst 33342(終濃度 10 μg/ml)，4 ℃ 避光染色15～20 min，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.5 Annexin V-FITC染色檢測MCF-7細(xì)胞凋亡

5×104個/ml細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔3 ml，24 h后以60 mg/L丹皮酚處理細(xì)胞，RPMI1640為對照，24 h、48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，按試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，激發(fā)波長488 nm。以CellQuest軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

60 mg/L的丹皮酚處理MCF-7細(xì)胞24 h、48 h后，Hoechst熒光染色結(jié)果顯示，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞變小，細(xì)胞核呈碎裂狀態(tài)，藍(lán)色激發(fā)光強(qiáng)于陰性對照組細(xì)胞，熒光變得致密，因此核被染成亮藍(lán)色，并可見明顯的粒狀熒光體聚集，新月體樣改變，凋亡小體形成等，以48 h后變化更明顯。見圖1。

圖1 丹皮酚對MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)

2.2 丹皮酚對細(xì)胞增殖活性的影響

丹皮酚處理MCF-7細(xì)胞24 h的IC50高于250 mg/L，而丹皮酚處理MCF-7細(xì)胞48 h后的IC50約是60 mg/L，說明丹皮酚作用48 h后對MCF-7細(xì)胞增殖具有直接抑制作用，并呈劑量依賴性關(guān)系。

2.3 Annexin V-FITC染色檢測MCF-7細(xì)胞凋亡

以60 mg/L丹皮酚處理MCF-7細(xì)胞24、48 h后，丹皮酚能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，60 mg/L丹皮酚24 h、48 h的凋亡百分?jǐn)?shù)分別為14.24%和28.47%，比對照組的凋亡百分?jǐn)?shù)(5.54%)明顯增加。

3 討論

MTT分析是以代謝還原MTT為基礎(chǔ)的方法。在細(xì)胞增殖過程中活細(xì)胞線粒體脫氫酶可將黃色可溶性MTT分子內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷裂形成藍(lán)紫色不溶性甲臜，DMSO可以使之溶解，酶標(biāo)儀則可在一定波長下檢測光密度值;死亡細(xì)胞中線粒體脫氫酶消失，無法使MTT還原，因此不能形成藍(lán)紫色甲臜，觀察不到顏色變化。MTT法較其他方法如臺盼藍(lán)計數(shù)法相比具有客觀性強(qiáng)、簡單易行等優(yōu)點，因此被廣泛用于抗腫瘤藥物的初篩。

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡 (PCD)，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡。通常認(rèn)為惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞是因為失控生長、過度增殖。從細(xì)胞凋亡的角度來看則認(rèn)為是腫瘤的凋亡機(jī)制受到抑制不能正常進(jìn)行細(xì)胞死亡清除的結(jié)果。許多化療藥物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，如紫杉醇、順鉑、長春新堿等，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也成為腫瘤治療的一個重要的策略。目前很多藥物的開發(fā)和研制都把誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作為藥物療效的一個衡量指標(biāo)〔4，5〕。

本試驗證明丹皮酚誘導(dǎo)了人MCF-7發(fā)生了細(xì)胞凋亡。丹皮酚通過誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗乳腺癌作用。

1 Tang B，Jiang J.Study of the CpG methylation status of ER alpha gene in estrogen receptor alpha-negative breast cancer cell lines and the role of hydralazine demethylation〔J〕.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2005;34(5)：283-7.

2 Mimura K，Baba S.Determination of paeonol metabolites in man by the use of stable isotopes〔J〕.Chem Pharm Bull，1981;18(7)：2043-50.

3 Wang J，Qingwang L，Yetao O，et al.Antitumor effects of paeonol on mice bearing EMT6 breast infiltrating ductal carcinoma〔J〕.Lat Am J Pharm，2010;29(5)：369-75.

4 Reed JC.Mechanisms of apoptosis〔J〕.Am J Pathol，2000;157(5)：1415-30.

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R737.9

A

〕 1005-9202(2012)22-4953-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.046

黑龍江省自然科學(xué)基金資助(No.D201063);黑龍江省教育廳科研項目(No.12521555)

1 佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院

齊建祥(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科臨床治療研究。

王建杰(1968-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥抗腫瘤分子機(jī)制的研究。

〔2012-03-20收稿 2012-04-10修回〕

(編輯 袁左鳴)