許 穎 曹明根 (上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院耳鼻喉科，上海 200031)

老年頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中Mir-301a對PTEN基因表達(dá)的調(diào)控

許 穎 曹明根 (上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院耳鼻喉科，上海 200031)

目的 研究老年頭部和頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)的分子機(jī)制。方法 利用基因組瀏覽器分析基因之間關(guān)系，并基于RealtimePCR檢測頭頸部鱗狀細(xì)胞癌及癌旁樣本中SKA2、PIK3CA、AKT1、mir-301a、PTEN基因表達(dá)量。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)mir-301a具有調(diào)控PTEN基因的靶向結(jié)合位點(diǎn)。RealtimePCR檢測發(fā)現(xiàn)癌旁組織中各個指標(biāo)在不同的臨床分期間沒有顯著性差異，但是癌組織中SKA2、PIK3CA、AKT1、mir-301a基因表達(dá)隨著腫瘤的惡化顯著增強(qiáng)，而PTEN的表達(dá)量則顯著下降。結(jié)論 PI3K/Akt信號通路異?；罨瘜?dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌;PTEN;Mir-301a;SKA2;PI3K/Akt

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)是一類臨床、病理、表型及生物學(xué)等多樣性表現(xiàn)的復(fù)雜疾病，鱗狀上皮的細(xì)胞及分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變是導(dǎo)致癌癥發(fā)生和發(fā)展的原因，其發(fā)病過程呈現(xiàn)由正常黏膜過度增生、異常增生、輕度、中度和重度原位癌、浸潤癌及癌轉(zhuǎn)移的多步驟過程。這一多步驟演變過程的每一階段都與一組相關(guān)分子發(fā)生變化有關(guān)〔1，2〕。本文通過基因組瀏覽器定位基因及TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測MicroRNA的靶基因，并通過基因表達(dá)水平的檢測推斷在HNSCC發(fā)生與發(fā)展過程中的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)收取我院病理科平均年齡(55±4.2)歲的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌及癌旁樣本22例，其中Ⅰ期患者3例，Ⅱ期4例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。

1.2 方法

總RNA抽提選用invitrogen公司的Trizol試劑，基因逆轉(zhuǎn)錄選用羅氏的RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，MicroRNA檢測選用Takara公司的MicroRNA qPCR檢測試劑盒。相關(guān)基因的檢測引物設(shè)計(jì)見表1。成熟miRNA的表達(dá)水平檢測也采用SYBR green法。特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，自備通用引物為miScript SYBR Green PCR Kit。前兩者構(gòu)成 miRNA 引物(見表1)，miRNA表達(dá)采用2－ΔΔCT法計(jì)算，U6 snRNA(GenBank Entrez：M14486)為內(nèi)參。采用 miScript Reverse Transcription計(jì)算KitmiRNA逆轉(zhuǎn)錄。在PCR管中加入5倍 RT 緩沖液 2 μl，總 RNA 1 μg，逆轉(zhuǎn)錄混合液 0.5 μl，Rnase free水補(bǔ)充至體積10 μl，混勻置于冰上。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)95℃5 min，37℃ 60 min，保存溫度 －20℃。試劑盒采用 miScript SYBR Green PCR Kit，利用ABI 7300 RealTime PCR儀實(shí)施PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2 × SYBR Green mix 10 μl。10 ×miSeript通用引物 2 μl，10 × 特異引物 2 μl，稀釋 cDNA 1 μl，Rnase free 水至體積20 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)反應(yīng)15 min;94℃15 s 55℃ 30 s 70℃ 34 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 SKA2及has-mir-301a的基因組定位

SKA2基因定位在人17號染色體長臂22區(qū)反義鏈上，其1號內(nèi)含子中含有hasmir-301a的前體序列，has-mir-301a隨ska2基因共同轉(zhuǎn)錄，并在SKA2內(nèi)含子剪切之后加工為成熟的MicroRNA。

表1 檢測基因及MicroRNA的引物設(shè)計(jì)

2.2 has-mir-301a與PTEN基因的靶向調(diào)控關(guān)系

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)mir-301a在PTEN的3'UTR區(qū)存在多個結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)為mir-301a調(diào)控PTEN基因的表達(dá)提供了基因結(jié)構(gòu)上的支持。見圖1。

圖1 has-mir-301a與PTEN基因靶向結(jié)合位點(diǎn)分析

2.3 基因表達(dá)及mir-301a表達(dá)的qPCR檢測

通過RealTime PCR 的方法檢測了SKA2、PIK3CA、AKT1、PTEN、GAPDH 及 mir-301a和 U6的表達(dá)量，以 GAPDH為內(nèi)參，分析了 SKA2、PIK3CA、AKT1、PTEN基因表達(dá)水平;以U6為內(nèi)參，分析了mir-301a的表達(dá)水平。

通過分析發(fā)現(xiàn)，在癌旁組織中各個指標(biāo)在不同的臨床分期間沒有顯著性差異，這可能與癌旁組織更接近與正常組織有關(guān)。而在癌組織中，隨著腫瘤的惡化，調(diào)控細(xì)胞分裂的SKA2基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，而抑癌基因PTEN的表達(dá)量則顯著下降，這也伴隨著mir-301a表達(dá)的逐步增強(qiáng)。另外，PTEN抑制的下游PI3k/AKT通路被明顯激活。通過基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)mir-301a與SKA2顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.985，而PTEN則與SKA2顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.951，PTEN與mir-301a、PIK3CA、AKT1在表達(dá)上均具負(fù)相關(guān)性，分別為 －0.935、－0.895、－0.946。見表2。

表2 癌與癌旁組織中各基因相對表達(dá)值±s)

表2 癌與癌旁組織中各基因相對表達(dá)值±s)

基因 Ⅰ期癌旁 癌Ⅱ期癌旁 癌Ⅲ期癌旁 癌Ⅳ期癌旁 癌01±0.03 3.17±0.13 1.01±0.03 3.78±0.16 PTEN 1±0.02 1.00±0.05 1.10±0.03 0.83±0.06 1.00±0.03 0.73±0.05 1.01±0.02 0.27±0.03 PIK3CA 1±0.03 1.42±0.09 1.01±0.04 1.79±0.23 1.02±0.04 3.03±0.20 1.01±0.05 3.76±0.22 AKT1 1±0.01 1.37±0.09 1.01±0.02 1.72±0.13 1.02±0.04 2.96±0.12 1.02±0.03 3.54±0.16 mir-301a 1±0.00 1.49±0.06 1.00±0.03 2.64±0.SKA2 1±0.02 1.66±0.13 1.03±0.01 2.81±0.10 1.05 0.99±0.03 2.65±0.11 1.01±0.03 3.75±0.13

3 討論

PTEN基因是具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23.3上，共有 9個外顯子，長 1 212 bp，mRNA長度為5.5 kb〔3〕。許多癌基因產(chǎn)物、受體有酪氨酸蛋白激酶活性及生長因子，使細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的酪氨酸殘基磷酸化，從而影響細(xì)胞的繁殖發(fā)育、生長分化等功能。PTEN可以將磷酸根從這些蛋白中除去，對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)控作用;對磷酸酪氨酸蛋白、磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白、3，4，5三磷脂酰肌醇均有脫磷酸作用〔4〕;抑制細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞凋亡〔5〕。SKA2為紡錘體與著絲粒連接復(fù)合物2亞基，具有調(diào)控微管聚合和解聚的功能，參與細(xì)胞周期及有絲分裂，位于人17號染色體長臂22區(qū)，位于反義鏈，具有4個外顯子和3個內(nèi)含子，有3種可變剪切方式(UCSC)，其一號內(nèi)含子中還有mir-301a。mir-301a與SKA2共用一個轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)，隨SKA2的轉(zhuǎn)錄而轉(zhuǎn)錄，并在SKA2內(nèi)含子剪切之后加工成熟。Cao等〔6～8〕在不同的細(xì)胞中均已驗(yàn)證出mir-301a是隨SKA2基因轉(zhuǎn)錄而轉(zhuǎn)錄的。MicroRNAs(miRNAs)是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成的具有21～23個堿基的單鏈小分子RNA，不同于siRNA(雙鏈)但是和siRNA關(guān)系密切。這些非編碼小分子RNA(miRNAs)很可能參與調(diào)控基因表達(dá)〔9〕。Mir-301a在結(jié)構(gòu)上與PTEN的3'UTR區(qū)具有互補(bǔ)性的結(jié)合位點(diǎn)〔10〕，且二者在本文所檢測的樣本中有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，這就提示了PTEN的表達(dá)可能是受到了mir-301a的調(diào)控。在HNSCC發(fā)生及發(fā)展過程中伴隨著PI3K/AKT通路的異?；罨?，而AKT的激活會抑制下游的凋亡相關(guān)基因Bax，激活凋亡抑制基因Bcl2，而該通路的活化會激活細(xì)胞的增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡，這在 Bonavida等〔11，12〕的研究中均有相同的發(fā)現(xiàn)。通過本研究提出一個假設(shè)，即在HNSCC發(fā)生及發(fā)展過程中，可能是由于SKA2的異常激活，共表達(dá)了mir-301a，從而抑制了抑癌基因PTEN的表達(dá)，引起了PI3K/AKT通路的異常激活，最終促進(jìn)了頭頸部鱗狀細(xì)胞的增殖而抑制了細(xì)胞的凋亡，從而使頭頸部鱗狀細(xì)胞發(fā)生癌變并逐漸惡化。而這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證明。

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R739.6

A

1005-9202(2012)22-4967-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.053

許 穎(1973-)，女，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻喉科疾病的診治研究。

〔2012-01-15收稿 2012-02-10修回〕

(編輯 袁左鳴)