張俊潔 李興

近年來，糖尿病心血管疾病已成為糖尿患者死亡主要原因之一，而未治療的糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)能迅速發(fā)展為心功能衰竭，所以其發(fā)生及發(fā)展過程中心肌病變的研究漸為人們所重視。多項(xiàng)研究認(rèn)為糖尿病患者高血糖通過蛋白激酶C機(jī)制，參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。脂聯(lián)素(Adiponectin，ADPN)是近年研究的熱點(diǎn)，許多研究顯示脂聯(lián)素在心衰和心室重構(gòu)過程中起到重要作用［1，2］，具有心臟保護(hù)功能。但國內(nèi)外關(guān)于脂聯(lián)素對高糖環(huán)境中HCM增殖報(bào)道較少，本研究旨在探討高糖環(huán)境下脂聯(lián)素對HCM增殖的影響，以揭示脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞的可能保護(hù)作用，從而為預(yù)防、治療糖尿病心肌病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人心肌細(xì)胞購于北方偉業(yè)發(fā)展有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，D-2葡萄糖、MTT試劑盒(美國Sigma公司)，脂聯(lián)素Human gAcrp(Pep rotech)，Trizol試劑(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.2 人心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 HCM培養(yǎng)于含10%胎牛血清、5.5 mmol/L D-葡萄糖、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，并置于含5%CO2的37°恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每3～4天用0.25%胰酶消化傳代，待細(xì)胞生長成亞融合狀態(tài)時(shí)。取部分細(xì)胞以1×104/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，改用無血清DMEM培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化生長24 h后，棄上清液，將其分為正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)、高糖組(30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)、脂聯(lián)素組 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培養(yǎng)液)，以備MTT用。剩余細(xì)胞換為無血清DMEM培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化生長24 h后，將其分為正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)、高糖組(30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)、脂聯(lián)素組 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培養(yǎng)液)。

1.3 MTT法測HCM增殖 每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔，進(jìn)行培養(yǎng)，為排除營養(yǎng)成分消耗對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差于48 h更換培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行MTT檢測，每孔加入 5 mg/ml的 MTT20 μl，繼續(xù)孵育 4 h，吸取上清，每孔加入二甲基亞楓(DMSO)150 μl，振蕩 10 min，于酶標(biāo)儀490nm處測吸光度(OD值)。

2 結(jié)果

在24 h高糖組與正常組比較人心肌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用(P＜0.05)，而高糖組與脂聯(lián)素組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。48、72 h高糖組與正常對照組比較細(xì)胞增殖受抑制(P＜0.05)。在加入脂聯(lián)素后48、72 h脂聯(lián)素組與高糖組比較細(xì)胞增殖增加，隨時(shí)間的延長細(xì)胞增殖增加明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。(見表1)

表1 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下HCM增殖的影響(OD值)(±s)(n=3)

表1 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下HCM增殖的影響(OD值)(±s)(n=3)

注:*P＜0.05;#P＜0.01

?

3 討論

糖尿病性心肌病是一種特異性的心肌病，是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，其典型病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大，心肌間質(zhì)增生及纖維化、心肌局灶性壞死、心肌血管壁增厚等。Braunwald等［3］認(rèn)為糖尿病心肌病的可能原因包括膠原和終末糖基化產(chǎn)物修飾的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白積聚，導(dǎo)致心肌的順應(yīng)性和舒張功能受損，心肌鈣調(diào)控異常，蛋白激酶-C(PKC)的激活，心臟自主神經(jīng)功能紊亂，基因突變等。病程早期以心臟舒張功能異常為主，后期收縮功能也受損，出現(xiàn)心力衰竭的臨床表現(xiàn)。其中，心肌細(xì)胞功能受損是糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞的增殖受到抑制，可能是由于高糖通過葡萄糖依賴性通路選擇性激活PKC，尤其是PKC-β1.從而引起細(xì)胞信號傳導(dǎo)異常而引起細(xì)胞凋亡和纖維化。Min等［4］通過對NF-кB途徑抑制檢測新生大白鼠心肌細(xì)胞中 PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos表達(dá)，認(rèn)為高血糖可以通過 PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起心肌細(xì)胞肥大。高糖還可激活p38MAKP，直接底物磷酸化AP-1、c-myc、c-jun 等，調(diào)節(jié)基因表達(dá)［5］，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。

ADPN是近年發(fā)現(xiàn)的一種由白色脂肪組織分泌的蛋白產(chǎn)物，由位于3q27的apM1基因編碼，相對分子質(zhì)量約3×104，具有244個(gè)氨基酸殘基。正常情況下，ADPN的血漿濃度為5～30ug/ml，約占總血漿蛋白量的0.01%。其是一種具有對糖尿病保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，多項(xiàng)研究證明其具有抗炎、抗纖維化、抗動脈粥樣硬化等多種作用。國外實(shí)驗(yàn)研究，Yajing［6］等對雄性小鼠心肌細(xì)胞經(jīng)脂聯(lián)素干預(yù)后也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡減少，起到對糖尿病心肌保護(hù)作用。對多種細(xì)胞研究顯示［7］:在活體內(nèi)ADPN下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，同時(shí)也可能抑制NF-Kb以及上調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄因子的激活。但目前對糖尿病心肌病研究較少，尤其脂聯(lián)素對心肌細(xì)胞保護(hù)的機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示加入脂聯(lián)素后阻斷了高糖對心肌細(xì)胞的損害，HCM增殖能力增加，并呈時(shí)間依賴性，提示脂聯(lián)素可能通過抗炎、抗纖維化作用直接或間接起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，為臨床應(yīng)用脂聯(lián)素治療糖尿病心肌病提供了理論依據(jù)。

［1］Fujioka D，Kawabata K，Saito Y，et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression infracted heart.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290:H2409-H2416.

［2］Liao Y，Takashima S，Maeda N，et al.Exacerbation of heart failure in adiponectin-deficient mice due to impaired regulation of AMPK and glucose metabolism.Cardiovasc Res，2005，67:705-713.

［3］Braunwald.Heart disease:A Textbook of Cardiovascular Medicine.6thed，2001:2133-2150.

［4］Min W，Bin ZW，Quin ZB，et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats.Cardiovasc Diabetol，2009，11:8-8.

［5］Way KJ，Isshiki K，Suzuma K，et al.Expression of connective tissue growth factor is increased ininjured myocardium associated with protein kinase C beta2 activation and diabetes.Diabetes，2002，51(9):2709-2718.

［6］Min W，Bin ZW，Quin ZB，et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats.Cardiovasc Diabetol，2009，11:8-8.

［7］Yajing W，Erhe G，Ling T，et al.AMP-activated protein kinase deficiency enhances myocardial ischemia/reperfusion injury but has minimal effect on the antioxidant/antinitrative protection of adiponectin.Circulation，2009，119:835-844.