張興權(quán)，代軍朋，蔡柏薔

1美國加州大學(xué) 圣地亞哥醫(yī)學(xué)院傳染病系, 拉霍亞，加州 92093 2石家莊四藥有限公司，石家莊 0521653中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100730

·論著·

鹽酸阿比朵爾體外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

張興權(quán)1，代軍朋2，蔡柏薔3

1美國加州大學(xué) 圣地亞哥醫(yī)學(xué)院傳染病系, 拉霍亞，加州 92093
2石家莊四藥有限公司，石家莊 052165
3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100730

目的檢測鹽酸阿比朵爾體外對2009新型流感病毒A(H1N1)復(fù)制的影響。方法采用2009新型流感病毒A(H1N1)感染MDCK細胞系統(tǒng)，檢測鹽酸阿比朵爾抗流感病毒的活性。血凝實驗、細胞病變保護實驗、RT-PCR 和定量RT-PCR實驗用于病毒滴度確定。使用Chou軟件系統(tǒng)計算藥物50%抑制病毒濃度和50%毒性濃度。結(jié)果鹽酸阿比朵爾在MDCK 細胞培養(yǎng)內(nèi)顯示毒性低(50%毒性濃度gt;100 μmol/L)，且明顯抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的復(fù)制。在血凝實驗、細胞病變保護實驗和定量RT-PCR檢測中， 鹽酸阿比朵爾50% 抑制病毒濃度分別為(5.5±0.9)、(3.4±0.8)和(1.5±0.2)μmol/L 。結(jié)論鹽酸阿比朵爾明顯抑制2009新型流感病毒A(H1N1)復(fù)制活性，而且具有誘生干擾素和免疫激活活性，作為一種抗流感病毒藥物，它是有價值的。

鹽酸阿比朵爾；2009新型流感病毒A(H1N1); RT-PCR

ActaAcadMedSin, 2012,34(2):126-129

目前，臨床使用的抗流感病毒藥物有4種，即金剛烷胺(amantadine)、金剛乙胺(remantadine)、扎那米韋(zanamivir) 和奧司他韋(oseltamivir)[1-2]。前兩種藥物最大的問題是因迅速產(chǎn)生耐藥病毒株而失去效果，因此在臨床上的應(yīng)用有限。扎那米韋和奧司他韋是流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑，對流感A、B和豬流感病毒均有明顯的抑制活性，其中口服的奧司他韋成為首選的一線藥物，但是目前已發(fā)現(xiàn)針對扎那米韋和奧司他韋的耐藥毒株。目前抗流感病毒藥物靶點窄、數(shù)量少、價格不菲，發(fā)展活性強、價格便宜和作用于病毒不同靶點的新藥勢在必行。鹽酸阿比朵爾(恩爾欣，arbidol) 系前蘇聯(lián)化學(xué)和制藥研究院研制的一種新型抗流感病毒藥物，目前已在少數(shù)國家臨床使用[3]。 文獻報道該藥明顯抑制季節(jié)性流感病毒復(fù)制，作用機制包括阻止病毒融合與復(fù)制、誘生干擾素、明顯提高自身免疫力[4-5]， 但對豬流感病毒的作用報道較少。本研究采用生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)探討鹽酸阿比朵爾對2009新型流感病毒A(H1N1)復(fù)制的影響。

材料和方法

材料MDCK 細胞系、CCL34細胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。培養(yǎng)基使用Eagle’s Minimal Essential 10%胎牛血清、1.0 mmol/L丙酮酸鈉, 0.1mmol/L MEM非必需氨基酸，1.5 g/L碳酸氫鈉，1%青霉素/鏈霉素。2009新型流感病毒A(H1N1)為美國加州圣地亞哥醫(yī)學(xué)院傳染病系提供。培養(yǎng)基為DMEM, 牛血清白蛋白2%, Herpes緩沖液25 mmol/L, TPCK-胰蛋白酶(Worthington 生物化學(xué)公司，Lakewood, NJ, USA)2 μg/ml。鹽酸阿比朵爾原料藥為石家莊四藥有限公司提供，奧司他韋由Hoffmann-La Roche公司提供。

藥物毒性測定2.5×106/ml MDCK 細胞懸液 200 μl 被種入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h致細胞單層長成。藥物被連續(xù)4倍稀釋，最高濃度為100 μmol/L, 每個藥物濃度為3孔。細胞毒性測定使用MTS(試劑盒 購自Promega公司, Madison, WI, USA)法，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

藥物活性測定2.5×106/ml MDCK 細胞懸液 200 μl 被種入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃ 、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h致細胞單層長成。配制病毒懸液至100倍50%細胞感染的病毒量, 含有細胞單層的每孔加入50 μl 病毒懸液，之后在37℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。用病毒培養(yǎng)基洗細胞1次， 然后在培養(yǎng)板內(nèi)加入4倍稀釋的藥物，最高藥物濃度為50 μmol/L。 培養(yǎng)72 h后鏡下觀察細胞病變程度，并收獲上清，用于血凝實驗、RT-PCR和 定量RT-PCR實驗。同時，觀察細胞病變(cytopathic effect, CPE)。奧司他韋作為陽性對照藥。

血凝實驗：準(zhǔn)備1個V型底的96孔板，每孔內(nèi)加入50 μl 收獲的上清液。隨后，50 μl 1% 豚鼠紅細胞加入每孔， 并輕輕混勻。室溫下放置 1 h。陰性結(jié)果是紅血球斑點集聚在孔中央，陽性結(jié)果是整個孔底形成均勻的紅色，病毒滴度是產(chǎn)生陽性反應(yīng)的最高稀釋度值。

CPE：在病毒感染和藥物處理72 h后，鏡下觀察給藥和病毒對照組病毒對細胞產(chǎn)生的致病變作用。 lt;25% CPE為“+”,25%～50% CPE為“++”, 50%～75%為“+++”，gt;75%為“++++”。

RT-PCR：收獲培養(yǎng)3d的細胞上清液，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN Sciences，MD，USA)提取流感病毒RNA,具體實驗程序嚴格按照試劑盒說明書進行。被提取的病毒RNA儲存在-70℃待用。隨后, 一步法RT-PCR 核酸放大在PCR 儀(C1000 Peltier Thermal Cycler，BIO-RAD Laboratories, Inc, CA, USA)內(nèi)進行。正義引物序列：5’-GTCCTATAAACACCAGCCTYCCA-3’；反義引物序列：5’-CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC-3’。反應(yīng)條件：50℃，30 min，逆轉(zhuǎn)錄；95℃，15 min。 94℃，15 s； 55℃，15 s；72℃，30 s；共40個循環(huán)。 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠分析，2009新型流感病毒A(H1N1)血凝毒(hemagglutinin, HA)的大小為115 bp。

定量RT-PCR：病毒RNA 與RT-PCR實驗中使用的相同。 定量RT-PCR采用一步定量RT-PCR試劑盒(Superscript Ⅲ Platinum One Step Quantitative RT-PCR System，Invitrogen)。核酸放大在PCR 儀(Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-time PCR system，Life Technologies，CA, USA)內(nèi)進行。引物：SWINFA-F-20: 5’-GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG-3’；SWINFA-R-20：5’-GTGRGCTGGGTTTTCATTTGGTC-3’。探針: SWINFA-P-5FAM-CYACTGCAAGCCCA(T-BHQ1)AC- ACACAAGCAGGCA-SpacerC3。反應(yīng)條件: 50℃，30 min；95℃，10 min。95℃，15 s變性；60℃ 1 min退火/伸展；共40個循環(huán)。

統(tǒng)計學(xué)處理50% 抑制濃度(inhibition concentration 50%, IC50)、50% 毒性濃度(cytotoxic concentration 50%, CC50)由 Chou Dose Effect Program 軟件計算決定[6]。

結(jié) 果

鹽酸阿比朵爾對2009新型流感病毒A(H1N1)的抑制活性鹽酸阿比朵爾對MDCK細胞毒性作用小，CC50gt;100 μmol/L。當(dāng)病毒預(yù)先感染細胞2 h后加入系列稀釋的藥物，3 d 后檢測HA 滴度，計算ID50為(5.5±0.9) μmol/L。 若將藥物和病毒同時加入細胞培養(yǎng)，藥物的IC50為(5.1±1.2)μmol/L, 與病毒預(yù)先感染2 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義。奧司他韋用于陽性對照，在病毒預(yù)先2 h感染細胞，ID50為(0.15±0.03) μmol/L。

在病毒預(yù)先感染細胞2 h后加入藥物，3 d后顯微鏡下觀察CPE，細胞對照組為發(fā)現(xiàn)病變，病毒對照組病變?yōu)椤?+++”，當(dāng)藥物濃度依次為50、25、12.5、6.25 和3.125 μmol/L時，CPE 順序為 “-”, “+”，“++”， “++”, “+++” (圖1)。計算 IC50為(3.4±0.8)μmol/L。

A-E.鹽酸阿比朵爾系列濃度為50, 25, 12.5, 6.25,3.125 μmol/L; F.病毒對照；G.細胞對照A-E.arbidol concentrations 50, 25, 12.5, 6.25,3.125 μmol/L; F.virus control; G.cell control圖1 鹽酸阿比朵爾對流感病毒致細胞病變的保護作用Fig 1 Protection of arbidol against cytopathic effect caused by influenza virus infection in MDCK cells

1-5：鹽酸阿比朵爾濃度分別為 25、12.5、6.25、3.125和1.5625 μmol/L；6：病毒對照1-5：arbidor concentrations are 25, 12.5, 6.25, 3.125, and 1.5625 μmol/L respectively;6: virus control圖2 RT-PCR方法檢測鹽酸阿比朵爾對流感病毒復(fù)制的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of arbidol on influenza virus replication (RT-PCR)

鹽酸阿比朵爾對病毒核酸復(fù)制的影響在加入藥物 3 d 后, RT-PCR 實驗結(jié)果顯示：25 μmol/L的鹽酸阿比朵爾明顯抑制病毒核酸產(chǎn)生，2009新型流感病毒A(H1N1)具有HA特異的115 bp帶缺失；與病毒對照相比，12.5、6.25和3.125 μmol/L鹽酸阿比朵爾也在一定程度上減少病毒核酸的復(fù)制(圖2)。在定量RT-PCR實驗中，未使用藥物的病毒對照組病毒RNA 拷貝數(shù) (×106)為 4.66±0.59;當(dāng)藥物濃度依次為25、12.5、 6.25 、3.125、1.5625和0.7813 μmol/L時，病毒 RNA 拷貝數(shù)分別為 0.25±0.11、0.18±0.08、0.67±0.38、2.56±0.83、2.03±0.48和2.33±0.48(圖3)。計算 IC50為(1.5±0.2)μmol/L。

圖3 定量RT-PCR方法檢測鹽酸阿比朵爾對流感病毒復(fù)制的抑制作用Fig 3 Inhibition of arbidol hydrochloride against influenza virus replication, as shown by quantitative RT-PCR

討 論

在過去的100多年內(nèi)，人流感病毒曾造成全球4次大流行，它們分別是1918年西班牙流感(A，H1N1)、1957年亞洲流感(A，H2N2)、1968年香港流感(A，H3N2) 和2009新型流感病毒A(H1N1)，亦稱豬流感病毒(swine flu virus) 感染[7]。2009新型流感病毒A(H1N1)流行已造成全球近萬人死亡，前3次流感大流行分別造成成百萬到上千萬人死亡，即使未發(fā)生流感大流行的年代，全世界每年也有25萬人死于流感并發(fā)癥[7-8]，因此防治流感及其并發(fā)癥的研究成為保障人類健康的重要課題。雖然流感病毒疫苗能有效地減輕感染的流行，但是流感病毒的抗原漂移和基因重組阻礙了疫苗的使用和效果，因此抗流感病毒的化療藥物在防治流感上發(fā)揮著重要的作用。

由于抗流感病毒化療藥物金剛烷胺和金剛乙胺臨床使用后迅速產(chǎn)生耐藥病毒株，致使其逐漸淡出第一線選擇的臨床藥物。扎那米韋和奧司他韋雖然具有較強的抑制流感病毒能力，但是逐漸顯現(xiàn)出的耐藥病毒株也給其臨床應(yīng)用帶來隱患[9]。此外，這兩種藥物價格較貴，致使在臨床上不能廣泛使用，尤其在發(fā)展中國家。更嚴峻的問題是抗流感病毒感染的藥物種類太少，所針對的病毒靶點窄，這給聯(lián)合用藥和替換用藥帶來困難。 針對上述問題的種種舉措正在深入發(fā)展中， 如為了控制豬流感病毒的流行，美國食品及藥物管理局特例批準(zhǔn)可用尚未上市的帕拉米韋(peramivir) 治療對奧司他韋耐藥的流感患者[10]。另外，一些作用于其他靶點的如針對病毒HA 蛋白、病毒RNA 聚合酶蛋白以及病毒神經(jīng)氨酸酶的新藥正在研制當(dāng)中[11]。

鹽酸阿比朵爾是從俄國引進的一種抗流感病毒感染的藥物。與奧司他韋不同，該藥不是病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑，它在細胞培養(yǎng)中對季節(jié)性流感病毒IC50在10～20 μmol/L, CC50在100 μmol/L左右[4-5]。本研究結(jié)果顯示鹽酸阿比朵爾在體外細胞培養(yǎng)實驗中對2009新型流感病毒A(H1N1)復(fù)制也具有抑制活性。IC50分別為5.5 (HA測定)、3.4 (CPE實驗)和1.5 μmol/L (定量RT-PCR)。本研究還確定鹽酸阿比朵爾對MDCK 細胞的毒性，TC50gt;100 μmol/L。盡管鹽酸阿比朵爾抑制流感病毒活性較低于奧司他韋，但鹽酸阿比朵爾還有誘生干擾素和活化巨噬細胞作用， 且該藥作用于病毒HA新靶點，價格稍便宜，因此鹽酸阿比朵爾是有廣泛應(yīng)用前途和有價值的抗流感病毒藥物。

為了讓更多的國家和地區(qū)接受鹽酸阿比朵爾，一些深入的研究應(yīng)該進行，包括鹽酸阿比朵爾與已知臨床藥物的協(xié)同作用研究、鹽酸阿比朵爾對奧司他韋等耐藥株的作用。此外，鹽酸阿比朵爾的作用機制應(yīng)更準(zhǔn)確地揭示和闡明。

綜上，鹽酸阿比朵爾在細胞培養(yǎng)中明顯抑制季節(jié)性流感病毒和2009新型流感病毒A(H1N1)的復(fù)制，且毒性較低，加之考慮到該藥有誘生干擾素和免疫激活作用，價格低于奧司他韋， 因此認為鹽酸阿比朵爾是有價值的抗流感病毒感染的藥物。

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Thein-vitroEffectsofArbidolHydrochlorideAgainst2009NewInfluenzaVirusA(H1N1)

ZHANG Xing-quan1，DAI Jun-peng2，CAI Bai-qiang3

1Infectious Disease Division, Medical School, University of California, San Diego L Jolla CA 92093，USA
2Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical Co. Ltd，Shijiazhuang 052165, China
3Department of Pulmonary Medicine,PUMC Hospital,CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

Corresponding auther: CAI Bai-qiang Tel: 010-69155039, FAX: 010-65231169,E-mail: caibq2009@hotmail.com

ObjectiveTo detect thein-vitroeffects of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1).MethodsThe activity of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1) was determined in MDCK cell cultures. Hemagglutination assay, observation of cytopathic effects, RT-PCR and quantitative RT-PCR tests were performed for determination of virus titers. Inhibition concentration 50% and cytotoxic concentration 50% were calculated with Chou’s Menu of Dose-Effect Program.ResultsArbidol hydrochloride showed low cytotoxicity (cytotoxic concentration 50%gt;100 μmol/L)and significant anti-2009 new influenza virus A (H1N1) activity in cell cultures. Inhibition concentration 50% were (5.5±0.9), (3.4±0.8), and (1.5±0.2) μmol/L in hemagglutination assay, cytopathic effect test, and quantitative RT-PCR assay, respectively.ConclusionArbidol has low cytotoxicity and high anti-virus activity and can effectively trigger the activities of interferon and immune response, and therefore can be a valuable anti-influenza virus drug.

arbidol hydrochloride; 2009 new influenza virus A (H1N1); RT-PCR

蔡柏薔 電話：010-69155039，傳真：010-65231169,電子郵件：caibq2009@hotmail.com

R 978.7； R373.1+3

A

1000-503X(2012)02-0126-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.005

2011-05-26)